Behandling av insektben for fluorescensmikroskopi: En metode for å bevare nevromuskulære strukturer for avbildning

Overview

Denne videoen beskriver en metode for å dissekere, fikse og montere Drosophila voksenben mens du bevarer nevromuskulaturen intakt for bildeanalyse.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Guan et al.,Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Benavhandling og fiksering

1. Ta en multibrønnplate i glass og fyll passende antall brønner med 70% etanol. Tilsett 15-20 CO 2-bedøvede fluer (av enten kjønn og enhver alder) til hver brønn, og ved å bruke en børste, forsiktig dab fluene inn i etanoloppløsningen til fluene er helt nedsenket.
   MERK: Dette trinnet er å fjerne hydrofobiskheten til kutikylen. Ikke vask i mer enn 1 min, fordi dette øker automatisk fluorescens av kutiklen.
2. Skyll fluene 3 ganger med 0,3% ikke-ionisk overflateaktivt vaskemiddeloppløsning i 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Hold fluene i denne løsningen i minst 10 minutter.
   MERK: Benene er bedre festet når de inkluderer vaskemiddel, noe som sannsynligvis vil øke penetrasjonen av fikseringsmiddelet inne i beinet.
3. Legg en flerbrønnsplate på isen sammen med et rør på 4% paraformaldehyd (PFA).
   MERK: Utarbeidelsen av fersk 4% PFA fra en 16% PFA etanolfri lagerløsning er kritisk.
4. Bruk tang for å fjerne hodet og magen på fluene uten å skade thoracic segmentet eller bena.
   MERK: Fjerning av magen gjør det lettere å holde flyet og dissekere bena.
5. Disseker bena fra thoraxsegmentet med tang og legg bena i brønnene som inneholder 4% PFA. For dette, skyv forsiktig, men fast ved coxa-thorax krysset ved hjelp av spissen av fine tang til benet løsner.
6. Fest bena i 4% PFA over natten ved 4 °C (ca. 20 timer totalt).
7. Vask bena med 0,3% ikke-ionisk overflateaktivt vaskemiddeloppløsning i 1x PBS, 5x i 20 minutter hver.
8. Bytt ut vaskebufferen med monteringsmedium. Hold benet i monteringsmediet i minst en dag før montering for å tillate fullstendig penetrasjon i benet.
   MERK: Hvis monteringsmediet er svært viskøst, fortynn monteringsmediet til 80% med 1x PBS fordi den plutselige endringen i viskositet kan føre til at kutiklet kollapser og skader den generelle strukturen på benet. Avhengig av Gal4-driveren, kan fluer bevares i 1 til 3 uker ved 4 °C i monteringsmedier til montering.

2. Montering av ben

1. Plasser ca. 20 μL 70 % glyserol på venstre side av et mikroskop og dekk med en firkantet 22 x 22 mm^{2 deksel} (Figur 1A,B). Pipette ca 10 μL monteringsmedium langs en linje parallelt med og i liten avstand fra høyre kant av denne dekslenlip. Tilsett ytterligere 30 μL monteringsmedium lenger på høyre side av lysbildet (Figur 1C).
   MERK: Ved påføring av en deksle over bena (se nedenfor) vil monteringsmediet forsiktig spre seg under dekslene og rundt bena uten å fortrenge dem.
2. Bruk fine tang løfte benet fra løsningen og forsiktig sette den på monteringsmediet nær venstre dekslerlip. Gjør det samme for hvert ben og juster dem fra topp til bunn (Figur 1D).
   1. Løft og overfør bena i en dråpe medium holdt mellom begge spissene på tangene. Orienter bena på to måter: ekstern side opp eller ned.
3. Når alle bena (opptil 6-8 ben kan monteres) er riktig justert, legg en ekstra deksleslip over bena slik at denne dekslen hviler litt på de tidligere plasserte dekslene, figur 1E for å gi plass mellom dekslene og vevet og for å forhindre at bena blir skadet (Figur 1G).
   MERK: Alternativt kan du bruke klistremerkebrønner eller kjeveortopedisk voks for å skape plass mellom dekslene og lysbildet.
4. Bruk en neglelakk til å feste posisjonen til dekslene i hvert hjørne (Figur 1F).
   MERK: Vevet er nå klart til å avbildes.

Representative Results

Figur 1: Prosedyre for å montere ben på mikroskopsklier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium