Обработка ног насекомых для флуоресценции микроскопии: метод сохранения нервно-мышечных структур для визуализации

Overview

Это видео описывает метод, чтобы вскрыть, исправить, и смонтировать drosophila взрослой ноги, сохраняя при этом его нейромускулатура нетронутыми для анализа изображений.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Вскрытие и фиксация ног

1. Возьмите стеклянную пластину из нескольких колодцев и заполните соответствующее количество колодцев 70% этанолом. Добавьте 15-20 CO_{2-анестезировано}мух (любого пола и любого возраста) к каждому хорошо и с помощью кисти, осторожно мазок мух в раствор этанола, пока мухи полностью погружены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в удалении гидрофобности кутикулы. Не мыть более 1 мин, потому что это увеличивает аутофлуоресценцию кутикулы.
2. Промыть мух 3 раза с 0,3% неионные сурфактант моющего средства раствора в 1x фосфат буфера солевого раствора (PBS). Держите мух в этом растворе, по крайней мере 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ноги лучше фиксируются при в том числе моющее средство, которое может увеличить проникновение фиксатора внутри ноги.
3. Поместите мульти-хорошо пластины на льду вместе с трубкой 4% параформальдегид (PFA).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка свежих 4% PFA из 16% PFA этанола свободного раствора запасов имеет решающее значение.
4. Используйте типсы, чтобы удалить голову и живот мух, не повреждая грудной сегмент или ноги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление живота облегчает проведение мухи и вскрыть ноги.
5. Рассекают ноги из грудного сегмента мипсами и поместите ноги в колодцы, содержащие 4% ПФА. Для этого, нажмите осторожно, но твердо на coxa-грудной клетки соединения с помощью кончика тонкой типсов, пока нога отделяется.
6. Исправить ноги в 4% PFA ночь при 4 градусов по Цельсию (примерно 20 ч в общей сложности).
7. Вымойте ноги с 0,3% неионные серфактант моющие средства раствор в 1x PBS, 5x в течение 20 минут каждый.
8. Замените стиральный буфер на монтажную среду. Держите ногу в монтажной среде, по крайней мере за день до монтажа, чтобы обеспечить ее полное проникновение в ногу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если монтажная среда очень вязкая, разбавьте монтажную среду до 80% с 1x PBS, потому что внезапное изменение вязкости может привести к коллапсу кутикулы и повреждению общей структуры ноги. В зависимости от водителя Gal4, мухи могут быть сохранены в течение 1 до 3 недель при 4 градусов по Цельсию в монтаже средств массовой информации до монтажа.

2. Монтаж ног

1. Поместите примерно 20 МКЛ 70% глицерола на левую сторону слайда микроскопа и накройте квадратным 22 x 22 мм² крышками(рисунок 1A,B). Pipette около 10 йл монтажной среды вдоль линии параллельно и на небольшом расстоянии от правого края этого крышки. Добавьте еще 30 МКЛ монтажной среды дальше по правой стороне слайда(рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При нанесении крышки на ноги (см. ниже) монтажная среда будет мягко распространяться под крышкой и вокруг ног, не вытесняя их.
2. С помощью тонких типсов поднимите ногу из раствора и аккуратно положите ее на монтажную среду рядом с левой крышкой. Сделайте то же самое для каждой ноги и выровнять их сверху вниз(рисунок 1D).
   1. Поднимите и перенесите ноги в капле среды, состоявшейся между обоими кончиками типсов. Ориентация ног двумя способами: внешняя сторона вверх или вниз.
3. После того, как все ноги (до 6-8 ноги могут быть установлены) должным образом выровнены, положить второй крышкой над ногами так, что это coverslip лежит немного на ранее размещенных крышки Рисунок 1E, чтобы пространство между крышкой и ткани и для предотвращения ног от повреждения (Рисунок 1G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте наклейки скважин или ортодонтический воск, чтобы создать пространство между крышкой и слайд.
4. Используйте лак для ногтей, чтобы обеспечить положение крышки на каждом углу(рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань теперь готова к изображению.

Representative Results

Рисунок 1: Процедура установки ног на слайдах микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium