Overview
Denne video beskriver en metode til mekanisk at fjerne chorion og vitelline membraner fra tidligere faste modne Drosophila oocytter. Den fremhævede protokol viser en detaljeret demonstration af proceduren, der giver oocytter, der er kompatible med fluorescerende in situ-hybridiseringsanalyser.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Perkins og Bickel, Brug Fluorescens In Situ Hybridization (FISH) til at overvåge tilstanden af Arm Samhørighed i Prometaphase og Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).
1. Fjernelse af chorions og vitelline membraner
BEMÆRK: Se figur 1 for nødvendige værktøjer.
- Separate sene stadie oocytter
- Der tilsættes 1 mL PBSBTx til en lav dissekeringsskål. Brug en P200 med en BSA belagt spids til at overføre faste æggestokke (i ~ 150 μL) i den lave skål. Pipette æggestokke op og ned med BSA belagt pipette spids til at løsne den modne oocytter fra de mindre modne oocytter.
- Når sene stadie oocytter er tilstrækkeligt adskilt, overføres alt væv til et 500 μL mikrofugerør. Overskydende væske fjernes med en trukket Pasteur-pipette, hvilket efterlader ca. 150 - 200 μL i røret. Gentag afsnit 1.1 for de resterende genotyper.
- Forbered dig på rullende
- Pre-våd en dyb brønd parabol med 200 μL PBSBTx. Cover og der er afsat. Få 3 matterede glasrutsjebaner, og sæt rutsjebanen #3 til side. Gnid forsigtigt de matterede glasregioner af rutsjebaner #1 og #2 sammen. Skyl dem i deioniseret vand for at fjerne eventuelle glas skår og tør med en engangs tørre.
- De frostede områder af rutsjebaner #1 og #2 med PBSBTx ved at tilsætte 50 μL PBSBTx til det ene dias og gnide dette område med det andet dias. Fjern væske med en engangsservietter.
- Placer diasene under et dissekerende mikroskop i den konfiguration, der er vist i figur 2A. Hold de frostede områder af dias #1 og #2 i kontakt med dias #3 understøttende dias #2.
- Rul oocytter; sikre, at rulleretningen altid er i en lige linje og aldrig en cirkulær bevægelse.
- Forbryd en P200 pipettespids i PBSBTx, og spred oocytterne i mikrofugerøret ved at pipettere op og ned. 50 μL væske, der indeholder oocytter, overføres til midten af den matterede glasdel af rutsjebanen #1. Løft dias #2 til at gøre dette.
- Langsomt lavere glide #2, indtil overfladen spændingen af væsken skaber en forsegling mellem de to matterede glas regioner. Der skal være nok væske til at dække det matterede område, men ingen bør siver ud. Hvis væsken er overfyldt, skal du bruge en trukket Pasteur-pipette til at fjerne overskydende væske.
- Hold det nederste dias (#1) på plads med den ene hånd, og brug den anden hånd til at flytte det øverste dias (#2) frem og tilbage i vandret retning, holde diaset #2 niveau og understøttes på dias #3. Udfør under et mikroskop for nem visualisering af oocytbevægelser og fremskridt.
BEMÆRK: Denne bevægelse vil generere friktion og få oocytterne til at "rulle" og miste deres chorions. Der skal anvendes et minimalt tryk, og bevægelserne skal være korte og hurtige. - Efter nogle få bevægelser i vandret retning ændres bevægelsesvinklen lidt (Figur 2B). I flere trin skal du gradvist øge denne vinkel til 90°, indtil bevægelsen af det øverste dias (#2) er vinkelret på startretningen (Figur 2B). Bemærk, at tomme chorions vil være synlige i væsken og oocytter mangler chorions vises længere og tyndere.
- Gentag trin 1.3.3 - 1.3.4 ca. 7 - 10 gange, indtil opløsningen bliver lidt overskyet. Stop rullende, når de fleste oocytter (75 - 85%) synes at have mistet deres vitelline membraner.
BEMÆRK: En karakteristisk spids ende er ofte synlig på oocytter, der mangler vitellinmembraner. Vitelline membraner er vanskeligere at fjerne end chorions. Der kan udøves let tryk på det øverste dias (glide #2), mens det rulles for at opnå fjernelse af vitellinmembraner. Forsøger at fjerne vitellin membraner fra alle oocytter ofte resulterer i ødelæggelse af andre oocytter. - Løft forsigtigt det øverste dias (#2), og træk et af hjørnerne til midten af det matterede område af det nederste dias (#1), så rullede oocytter akkumuleres i midten af det matterede område. Skyl oocytter fra begge rutsjebaner med PBSBTx ind i den dybe brøndskål, der indeholder PBSBTx.
- Rengør rutsjebaner #1 og #2 med ultrapure vand, tør med en engangstørring og nulstil. Gentag trin 1.3.1 - 1.3.6, indtil alle oocytter af samme genotype er rullet. Dette kræver normalt 3 - 4 runder af rullende per genotype.
- Fjern snavs efter rulning
- Der tilsættes 1 mL PBSBTx til et konisk rør på 15 mL. Slyng væsken for at belægge rørets sider.
- Ved hjælp af en PBSBTx-belagt P1000 pipettespids overføres de valsede oocytter fra den dybe brøndskål til det koniske rør, der indeholder 1 mL PBSBTx. Tilsæt yderligere 2 mL PBSBTx til konisk rør, der indeholder oocytterne.
- Lad oocytterne begynde at slå sig ned til bunden, fjern derefter de øverste 2 ml opløsning, der indeholder snavs (chorions, vitellines osv.)med en P1000 og kassér. Hvis det er nødvendigt, skal du holde det koniske rør mod en mørk baggrund for at se de uigennemsigtige oocytter, når de synker.
- Tilsæt yderligere 2 mL PBSBTx til oocytterne, og gentag trin 1.4.3. Gentag 1.4.3. i alt 3 runder af snavs fjernelse.
- Ved hjælp af en PBSBTx belagt P1000 pipettespids overføres oocytter tilbage til det oprindelige mikrofugerør på 500 μL. 20 - 25 hunner skal give ca. 50 μL valsede modne oocytter.
- Gentag afsnit 4 for de resterende genotyper ved hjælp af friske frostede dias, en ren dyb brøndskål og et nyt konisk rør for hver genotype.
- Hvis opbevaring er nødvendig, overføres oocytter til 1x PBS med 0,1% TritionX-100 og opbevares natten over ved 4 °C. Langtidsopbevaring anbefales ikke, fordi formaldehyd crosslinking kan vendes ved hjælp af nonioniske rengøringsmidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Cytologiværktøjer. Værktøj, der anvendes i protokol: (1) par pincet (#5 Dumont); 2) wolframnål 3) dyb brøndskål med dæksel 4) af dissekeringsskål af lavt glas (5) trukket Pasteur pipette. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arrangement og bevægelse af lysbilleder til valsning af oocytter. (A) Diagram over det dias, der er indstillet til valsning af oocytter som beskrevet i protokollen. Det mørkere område angiver den matterede glasdel af rutsjebanen. (B) Bevægelsesvektorernes retning for glidende #2 under oocytvalsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9" Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| Kimwipes | Various | disposable wipes |
