Korion og vitelline membran mekanisk fjerning: En metode for å forberede Drosophila Oocytes for direkte observasjon

Overview

Denne videoen beskriver en metode for å mekanisk fjerne kor- og vitellinemembranene fra tidligere faste modne Drosophila oocytter. Den omtalte protokollen viser en detaljert demonstrasjon av prosedyren som gir oocytter kompatible med fluorescerende in situ hybridiseringsanalyser.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Perkins og Bickel, Ved hjelp av Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) for å overvåke tilstanden til armsammenslutning i Prometaphase og Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Fjerning av korioner og vitellinemembraner

MERK: Se figur 1 for nødvendig verktøy.

1. Separate oocytter i sen fase
   1. Tilsett 1 ml PBSBTx i en grunn dissekeringsfat. Bruk en P200 med en BSA-belagt spiss for å overføre faste eggstokkene (i ~ 150 μL) til den grunne parabolen. Pipette eggstokkene opp og ned med BSA belagt pipettespiss for å løsne de modne oocyttene fra de mindre modne oocyttene.
   2. Når senfase oocytter er tilstrekkelig separert, overfør alt vevet til et 500 μL mikrofugerør. Fjern overflødig væske med en trukket Pasteur pipette, og la ca 150 - 200 μL i røret. Gjenta inndeling 1.1 for gjenværende genotyper.
2. Forbered deg på å rulle
   1. For-våt en dyp brønnrett med 200 μL PBSBTx. Dekk og sett til side. Få 3 frostede glasssklier og sett glid #3 til side. Gni forsiktig de frostede glassområdene med lysbilder #1 og #2 sammen. Skyll dem i deionisert vann for å fjerne glassskår og tørk med en engangsserviett.
   2. Belegge de frostede områdene med lysbilder #1 og #2 med PBSBTx ved å legge til 50 μL PBSBTx i ett lysbilde og gni denne regionen med det andre lysbildet. Fjern væske med en engangsserviett.
   3. Plasser lysbildene under et dissekeringsmikroskop i konfigurasjonen som vises i figur 2A. Hold de frostede områdene med lysbilder #1 og #2 i kontakt, med skyv #3 støttelysbilde #2.
3. Rull oocytter; sørg for at rulleretningen alltid er i en rett linje og aldri en sirkulær bevegelse.
   1. Forkjøp en P200 pipettespiss i PBSBTx og spre oocyttene i mikrofugerøret ved å pipettere opp og ned. Overfør 50 μL væske som inneholder oocytter til midten av den frostede glassdelen av lysbildet #1. Løft skredet #2 for å gjøre dette.
   2. Senk gli sakte #2 til væskens overflatespenning skaper en forsegling mellom de to frostede glassområdene. Det skal være nok væske til å dekke det frostede området, men ingen skal siver ut. Hvis væsken er overfylt, bruk en trukket Pasteur pipette for å fjerne overflødig væske.
   3. Hold det nederste lysbildet (#1) på plass med den ene hånden, og bruk den andre hånden til å flytte det øverste lysbildet (#2) frem og tilbake i vannrett retning, og hold lysbildet #2 nivå og støttet på #3. Utfør under et mikroskop for enkel visualisering av oocyttbevegelser og fremgang.
      MERK: Denne bevegelsen vil generere friksjon og føre til at oocyttene "ruller" og mister sine chorions. Minimalt trykk bør brukes og bevegelser skal være korte og raske.
   4. Etter noen bevegelser i horisontal retning endrer du bevegelsesvinkelen litt (Figur 2B). I flere intervaller øker du gradvis denne vinkelen til 90° til bevegelsen av det øverste lysbildet (#2) står vinkelrett på startretningen (Figur 2B). Legg merke til at tomme chorions vil være synlige i væsken og oocytter som mangler chorions vil vises lenger og tynnere.
   5. Gjenta trinn 1.3.3 - 1.3.4 ca 7 - 10 ganger til løsningen blir litt overskyet. Slutt å rulle når de fleste oocytter (75 - 85%) ser ut til å ha mistet vitellinemembranene sine.
      MERK: En særegen spiss ende er ofte synlig på oocytter som mangler vitelline membraner. Vitelline membraner er vanskeligere å fjerne enn korioner. Lett trykk kan påføres toppskuffen (skyv #2) mens du ruller for å oppnå fjerning av vitellinemembraner. Å prøve å fjerne vitelline membraner fra alle oocytter resulterer ofte i ødeleggelse av andre oocytter.
   6. Løft forsiktig det øverste lysbildet (#2), dra et av hjørnene til midten av det frostede området av bunnsklie (#1) slik at rullede oocytter akkumuleres i midten av frostområdet. Skyll oocytter fra begge lysbildene med PBSBTx i den dype brønnfatet som inneholder PBSBTx.
   7. Rengjør sklier #1 og #2 med ultrarent vann, tørk med en engangsserviett og tilbakestill. Gjenta trinn 1.3.1 - 1.3.6 til alle oocyttene av samme genotype er rullet. Dette krever vanligvis 3 - 4 runder med rulling per genotype.
4. Fjern rusk etter rulling
   1. Legg 1 ml PBSBTx til et konisk rør på 15 ml. Virvle væsken for å belegge sidene av røret.
   2. Bruk en PBSBTx-belagt P1000 pipettespiss, overfør de valsede oocyttene fra den dype brønnfatet til det koniske røret som inneholder 1 ml PBSBTx. Tilsett ytterligere 2 ml PBSBTx til det koniske røret som inneholder oocyttene.
   3. La oocyttene begynne å bosette seg til bunnen, fjern deretter de øverste 2 ml oppløsning som inneholder rusk (chorions, vitellines, etc.) med en P1000 og kast. Hold om nødvendig det koniske røret mot en mørk bakgrunn for å se de ugjennomsiktige oocyttene når de synker.
   4. Legg til ytterligere 2 ml PBSBTx i oocyttene, og gjenta trinn 1.4.3. Gjenta 1.4.3. for totalt 3 runder med fjerning av rusk.
   5. Bruk en PBSBTx-belagt P1000 pipettespiss til å overføre oocytter tilbake til det originale 500 μL mikrofugerøret. 20 - 25 kvinner skal gi ca 50 μL valsede modne oocytter.
5. Gjenta avsnitt 4 for de resterende genotypene ved hjelp av friske frostede lysbilder, en ren dyp brønnfat og et nytt konisk rør for hver genotype.
6. Hvis lagring er nødvendig, overfør oocytter til 1x PBS med 0,1% TritionX-100 og oppbevar over natten ved 4 °C. Langvarig lagring anbefales ikke fordi formaldehyd krysskobling kan reverseres av ikke-ioniske vaskemidler.

Representative Results

Figur 1: Cytologiverktøy. Verktøy som brukes i protokollen: (1) par tang (#5 Dumont); (2) wolfram nål; (3) dyp brønnrett med deksel; (4) grunt glass dissekering parabolen; (5) trukket Pasteur pipette. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Arrangement og bevegelse av lysbilder for rullende oocytter. (A) Diagram over lysbildet som er satt opp for rulling av oocytter som beskrevet i protokollen. Det mørkere området betegner den frostede glassdelen av lysbildet. (B) Bevegelsesretningsvektorer for skyv #2 under oocyttrulling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes