Eliminación mecánica de membranas de colina y vitellina: Un método para preparar ocitos de Drosophila para observación directa

Overview

Este video describe un método para eliminar mecánicamente las membranas de coral y vitellina de ocitos drosophila maduros previamente fijos. El protocolo destacado muestra una demostración detallada del procedimiento que produce ocitos compatibles con ensayos fluorescentes de hibridación in situ.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Perkins y Bickel, utilizando fluorescencia in situ hibridación (FISH) para monitorear el estado de cohesión del brazo en Prometafase y Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Eliminación de corales y membranas vitellinas

NOTA: Consulte la Figura 1 para ver las herramientas necesarias.

1. Ócitos separados en etapas tardías
   1. Añade 1 mL PBSBTx a un plato de disección poco profundo. Utilice un P200 con una punta recubierta BSA para transferir ovarios fijos (en ~150 μL) en el plato poco profundo. Ovarios de pipeta arriba y abajo con la punta de pipeta recubierta BSA para desalojar los ovocitos maduros de los ovocitos menos maduros.
   2. Cuando los ocitos en etapa tardía estén suficientemente separados, transfiera todo el tejido a un tubo de microfugio de 500 μL. Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur extraída, dejando alrededor de 150 - 200 μL en el tubo. Repita la sección 1.1 para los genotipos restantes.
2. Prepárense para rodar
   1. Pre-mojar un plato de pozo profundo con 200 μL de PBSBTx. Cubrir y reservar. Obtenga 3 toboganes de vidrio esmerilado y reserve #3 de diapositivas. Frote suavemente las regiones de vidrio esmerilado de los toboganes #1 y #2 juntos. Enjuáguelos en agua desionizada para eliminar cualquier fragmento de vidrio y secar con una toallita desechable.
   2. Cubra las regiones esmeriladas de diapositivas #1 y #2 con PBSBTx añadiendo 50 μL de PBSBTx a una diapositiva y frotando esta región con la otra diapositiva. Retire el líquido con una toallita desechable.
   3. Coloque las diapositivas bajo un microscopio diseccionador en la configuración que se muestra en el cuadro 2A. Mantenga las regiones esmeriladas de diapositivas #1 y #2 en contacto, con diapositivas #3 #2 de diapositivas compatibles.
3. Ócitos de rollo; asegurar que la dirección de la rodadura esté siempre en línea recta y nunca en un movimiento circular.
   1. Prewet una punta de pipeta P200 en PBSBTx y dispersar los ocitos en el tubo de microfugio pipeteando arriba y abajo. Transfiera 50 μL de líquido que contenga ocitos al centro de la parte de vidrio esmerilado de la #1 deslizante. Levante el #2 de diapositivas para ello.
   2. Deslice lentamente #2 hasta que la tensión superficial del líquido cree un sello entre las dos regiones de vidrio esmerilado. Debe haber suficiente líquido para cubrir el área helada, pero ninguno debe estar filtrando. Si el líquido se desborda, use una pipeta Pasteur extraída para eliminar el exceso de líquido.
   3. Mantenga la diapositiva inferior (#1) en su lugar con una mano y utilice la otra mano para mover la diapositiva superior (#2) de un lado a otro en una dirección horizontal, manteniendo la diapositiva #2 nivel y apoyada en la #3 de diapositivas. Realice bajo un microscopio para una fácil visualización de los movimientos y el progreso de los ócitos.
      NOTA: Este movimiento generará fricción y hará que los ocitos "rueden" y pierdan sus corales. Se debe utilizar una presión mínima y los movimientos deben ser cortos y rápidos.
   4. Después de algunos movimientos en la dirección horizontal, cambie ligeramente el ángulo de movimiento (Figura 2B). En múltiples incrementos, aumente gradualmente este ángulo a 90° hasta que el movimiento de la diapositiva superior (#2) sea perpendicular a la dirección inicial (Figura 2B). Tenga en cuenta que los corales vacíos serán visibles en el líquido y los ocitos que carecen de corales aparecerán más largos y delgados.
   5. Repita los pasos 1.3.3 - 1.3.4 unas 7 - 10 veces hasta que la solución se nubla ligeramente. Dejar de rodar cuando la mayoría de los ocitos (75 - 85%) parecen haber perdido sus membranas vitellinas.
      NOTA: Un extremo puntiagudo distintivo es a menudo visible en ocitos que carecen de membranas vitellinas. Las membranas vitellinas son más difíciles de eliminar que las corales. La presión de luz se puede aplicar a la diapositiva superior (#2 deslizante) mientras se enrolla para lograr la eliminación de membranas vitellinas. Tratar de eliminar las membranas vitellinas de todos los ocitos a menudo resulta en la destrucción de otros ocitos.
   6. Levante suavemente el tobogán superior (#2), arrastrando una de sus esquinas hasta el centro de la región helada de la diapositiva inferior (#1) para que los ocitos enrollados se acumulen en el centro de la región helada. Enjuague los ocitos de ambas diapositivas con PBSBTx en el plato de pozo profundo que contiene PBSBTx.
   7. Limpie los toboganes #1 y #2 con agua ultrapura, seque con una toallita desechable y restablezca. Repita los pasos 1.3.1 - 1.3.6 hasta que se hayan enrollado todos los ócitos del mismo genotipo. Esto generalmente requiere 3 - 4 rondas de rodadura por genotipo.
4. Retire los escombros después de rodar
   1. Añadir 1 mL PBSBTx a un tubo cónico de 15 ml. Arremolina el líquido para cubrir los lados del tubo.
   2. Usando una punta de pipeta PBSBTx recubierta P1000, transfiera los ocitos enrollados del plato del pozo profundo al tubo cónico que contiene 1 ml de PBSBTx.
   3. Deje que los ocitos comiencen a establecerse en la parte inferior, luego retire la parte superior 2 ml de solución que contiene residuos (corales, vitellines, etc.)con un P1000 y deseche. Si es necesario, sostenga el tubo cónico sobre un fondo oscuro para ver los ócitos opacos mientras se hunden.
   4. Agregue 2 ml adicionales de PBSBTx a los ocitos y repita el paso 1.4.3. Repita 1.4.3. para un total de 3 rondas de remoción de escombros.
   5. Utilizando una punta de pipeta PBSBTx recubierta P1000, transfiera ocitos de nuevo al tubo de microfugio original de 500 μL. 20 - 25 hembras deben producir aproximadamente 50 μL de ocitos maduros enrollados.
5. Repita la sección 4 para los genotipos restantes utilizando toboganes esmerilados frescos, un plato limpio de pozo profundo y un nuevo tubo cónico para cada genotipo.
6. Si es necesario almacenar, transfiera ocitos a 1x PBS con 0.1% TritionX-100 y almacene durante la noche a 4 °C. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo porque el enlace cruzado de formaldehído puede ser invertido por detergentes no iónicos.

Representative Results

Figura 1: Herramientas de citología. Herramientas utilizadas en protocolo: (1) par de fórceps (#5 Dumont); (2) aguja de tungsteno; (3) plato de pozo profundo con cubierta; (4) plato diseccionador de vidrio poco profundo; (5) sacó la pipeta Pasteur. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disposición y movimiento de diapositivas para ocitos rodantes. (A) Diagrama de la diapositiva configurada para la rodadura de ocitos como se describe en el protocolo. El área más oscura denota la parte de vidrio esmerilado de la diapositiva. (B) Dirección de vectores de movimiento para la #2 de diapositivas durante la rodadura de ocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes