Mekanisk borttagning av chorion- och vitelinmembran: En metod för att förbereda Drosophila-oocyter för direkt observation

Overview

Denna video beskriver en metod för att mekaniskt ta bort chorion och vitelline membran från tidigare fasta mogna Drosophila äggceller. Det presenterade protokollet visar en detaljerad demonstration av förfarandet som ger äggceller som är kompatibla med fluorescerande in situ hybridisering analyser.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Perkins och Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Avlägsnande av korioner och vitelina membran

OBS: Se figur 1 för verktyg som behövs.

1. Separata oocyter i sen fas
   1. Tillsätt 1 ml PBSBTx till en grund dissekeringsform. Använd en P200 med en BSA-belagd spets för att överföra fasta äggstockar (i ~150 μL) till den grunda skålen. Pipett äggstockar upp och ner med BSA belagda pipettspets för att lossa de mogna äggcellerna från de mindre mogna äggcellerna.
   2. När oocyter i sen fas är tillräckligt separerade överför du all vävnad till ett 500 μL mikrofugerör. Ta bort överflödig vätska med en dragen Pasteur-pipett och lämna ca 150 - 200 μL i röret. Upprepa avsnitt 1.1 för återstående genotyper.
2. Förbered för rullning
   1. Förtjälk en djup brunnsform med 200 μL PBSBTx. Täck och ställ åt sidan. Få 3 frostade glasrutschbanor och ställ #3 åt sidan. Gnugga försiktigt de frostade glasregionerna av diabilder #1 och #2 tillsammans. Skölj dem i avjoniserat vatten för att ta bort glasskärvor och torka med en engångsservett.
   2. Täck de frostade områdena av diabilder #1 och #2 PBSBTx genom att lägga till 50 μL PBSBTx till en bild och gnugga denna region med den andra bilden. Ta bort vätskan med en engångsservett.
   3. Placera bilderna under ett dissekerande mikroskop i konfigurationen som visas i figur 2A. Håll de frostade områdena av diabilder #1 och #2 i kontakt, med #3 som stöder #2.
3. Rulla äggceller; se till att rullriktningen alltid är i en rak linje och aldrig en cirkulär rörelse.
   1. Förväxlar en P200 pipettspets i PBSBTx och sprid äggcellerna i mikrofugeröret genom att leda upp och ner. Överför 50 μL vätska som innehåller äggceller till mitten av den frostade glasdelen av #1. Lyft glid #2 att göra detta.
   2. Långsamt lägre glid #2 tills vätskans ytspänning skapar en tätning mellan de två frostade glasregionerna. Det ska finnas tillräckligt med vätska för att täcka det frostade området men ingen bör sippra ut. Om vätskan svämmar över, använd en utdragen Pasteur-pipett för att avlägsna överflödig vätska.
   3. Håll den nedre bilden (#1) på plats med ena handen och använd den andra handen för att flytta den övre bilden (#2) fram och tillbaka i vågrät riktning, hålla bilden #2 nivå och stöds på #3. Utför under ett mikroskop för enkel visualisering av oocytrörelser och framsteg.
      OBS: Denna rörelse kommer att generera friktion och få äggcellerna att "rulla" och förlora sina chorions. Minimalt tryck bör användas och rörelserna ska vara korta och snabba.
   4. Efter några rörelser i horisontell riktning, ändra rörelsevinkeln något (Figur 2B). Öka gradvis denna vinkel till 90° i flera steg tills den övre bildens rörelse (#2) är vinkelrät mot startriktningen (bild 2B). Observera att tomma chorions kommer att vara synliga i vätskan och äggceller som saknar chorions kommer att visas längre och tunnare.
   5. Upprepa steg 1.3.3 - 1.3.4 ca 7 - 10 gånger tills lösningen blir något grumlig. Sluta rulla när majoriteten av äggcellerna (75 - 85%) verkar ha förlorat sina vitelina membran.
      OBS: En distinkt spetsig ände är ofta synlig på äggceller som saknar vitelina membran. Vitelina membran är svårare att ta bort än chorions. Ljustryck kan appliceras på den övre bilden (skjut #2) medan du rullar för att uppnå avlägsnande av vitelina membran. Att försöka ta bort vitelina membran från alla äggceller resulterar ofta i förstörelse av andra äggceller.
   6. Lyft försiktigt den övre bilden (#2) och dra ett av dess hörn till mitten av den frostade regionen i den nedre bilden (#1) så att rullade äggceller ackumuleras i mitten av den frostade regionen. Skölj äggceller från båda bilderna med PBSBTx i djupbrunnen som innehåller PBSBTx.
   7. Rengör diabilder #1 och #2 med ultrapurevatten, torka med en engångsservett och återställ. Upprepa steg 1.3.1 - 1.3.6 tills alla äggceller av samma genotyp har rullats. Detta kräver vanligtvis 3 - 4 rundor rullande per genotyp.
4. Ta bort skräp efter rullning
   1. Tillsätt 1 ml PBSBTx till ett koniskt rör på 15 ml. Snurra vätskan för att täcka rörsidorna.
   2. Använd en PBSBTx-belagd P1000-pipettspets och överför de valsade äggcellerna från djupbrunnsskålen till det koniska röret som innehåller 1 ml PBSBTx. Tillsätt ytterligare 2 ml PBSBTx till det koniska röret som innehåller äggcellerna.
   3. Låt äggcellerna börja bosätta sig till botten, ta sedan bort de översta 2 ml lösning som innehåller skräp (chorions, vitellines, etc.) med en P1000 och kassera. Om det behövs, håll det koniska röret mot en mörk bakgrund för att se de ogenomskinliga äggcellerna när de sjunker.
   4. Tillsätt ytterligare 2 ml PBSBTx till äggcellerna och upprepa steg 1.4.3. Upprepa 1.4.3. för totalt 3 omgångar skräpborttagning.
   5. Använd en PBSBTx-belagd P1000 pipettspets och överför oocyter tillbaka till det ursprungliga 500 μL mikrofugeröret. 20 - 25 honor bör ge cirka 50 μL rullade mogna äggceller.
5. Upprepa avsnitt 4 för de återstående genotyperna med färska frostade diabilder, en ren djup brunnsform och ett nytt koniskt rör för varje genotyp.
6. Om lagring är nödvändig, överför äggceller till 1x PBS med 0,1% TritionX-100 och förvara över natten vid 4 °C. Långtidslagring rekommenderas inte eftersom formaldehydkorslänkning kan vändas av icke-joniska rengöringsmedel.

Representative Results

Figur 1: Cytologiverktyg. Verktyg som används i protokollet: (1) par tång (#5 Dumont); 2. Volframnål. (3) djup brunnsform med lock; 4. Grunt glas dissekeringsfat. (5) drog Pasteur pipett. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Placering och förflyttning av diabilder för rullande äggceller. a) Diagram över den bild som ställts in för rullning av äggceller enligt beskrivningen i protokollet. Det mörkare området betecknar den frostade glasdelen av rutschkanan. b) Rörelsevektorernas riktning för glidbanor #2 oocytrullning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes