Overview
تعمل الهيموليم Drosophila كسائل دموي وسلس الخلالي على حد سواء ، ويتم تداولها في جميع أنحاء الجسم خلال مراحل اليرقة والبالغين. يصف هذا الفيديو بروتوكولا لجمع الهيموليم اليرقات من أجل تحديد الخلايا المتداولة.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من ريملز وبفليغر، طرق لفحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في يرقات دروسوفيلا، J. Vis. Exp. (2016).
1. تعميم تركيز الخلايا الدموية
- للحصول على يرقات من نفس المرحلة التنموية تقريبا لهذا الفحص ، قم بتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث بوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2 إلى 6 ساعات.
- جمع اليرقات في تشريح آبار طبق مليئة 1x الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
- لكل يرقة ، ضع 10 ميكرولتر 1x PBS في أنبوب طرد دقيق على الجليد و 10 ميكرولتر 1x PBS على لوحة تشريح نظيفة. ضع لوحة التشريح على قاعدة مجسمة مضيئة.
- جفف يرقة فردية عن طريق وضعها على مسح الأنسجة قبل نقلها إلى قطرة PBS على لوحة التشريح.
- باستخدام زوج من ملقط، المسيل للدموع بلطف مفتوحة وعكس بعناية لطيف للافراج عن hemolymph.
ملاحظة: الحرص على عدم كشط أو ضربة بالكوع على الجلد لأن هذا يمكن أن تطلق خلايا الدم sessile. - باستخدام ماصة ، وجمع hemolymph من لوحة تشريح. تجنب جمع حطام اليرقات مثل الجسم الدهني.
- إضافة hemolymph إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتخلط عن طريق pipetting صعودا وهبوطا.
ملاحظة: يمكن جمع عدة عينات في وقت واحد والاحتفاظ بها على الجليد لمدة تصل إلى ساعة. - اختياري: مزيج تريبان الأزرق مع عينة hemolymph في أجزاء متساوية لصبغ واستبعاد الخلايا الميتة. عد الخلايا في غضون 3 دقائق من إضافة تريبان الأزرق لأنه سام للخلايا.
- اخلط العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا قبل تحميل 10 ميكرولتر في غرفة مقياس الدم.
- إذا كنت تستخدم عداد خلايا مؤتمت، قم بتعيين المعلمات المناسبة لحجم الخلية ولتعميمها. على سبيل المثال، تعيين الحد الأدنى لحجم الخلية من 2 ميكرومتر، والحد الأقصى لحجم الخلية من 22 ميكرومتر، ودائرية من 75-80٪ استدارة للكشف عن الخلايا الدموية العادية، جولة. جرب معلمات مختلفة للكشف عن الخلايا الدموية الكبيرة والمغزلية الشكل، مثل الخلايا اللاميلوسية. بدلا من ذلك، استخدم مقياس الدم لحساب خلايا الدم يدويا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
