Overview
ड्रोसोफिला हीमोलिमिम्फ लार्वा और वयस्क चरणों के दौरान पूरे शरीर में घूम रहा है, रक्त और मध्यवर्ती तरल पदार्थ दोनों के रूप में कार्य करता है। यह वीडियो परिसंचारी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए लार्वा हीमोलिम्फ एकत्र करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल रेमेल्स और फलेगर से एक अंश है, ड्रोसोफिला लार्वा, जे विस एक्सपी (2016) में लिम्फ ग्रंथि और हीमोसाइट्स की जांच करने के तरीके।
1. परिसंचारी हीमोसाइट एकाग्रता
- इस परख के लिए लगभग एक ही विकासात्मक चरण के लार्वा प्राप्त करने के लिए, महिलाओं को 2 - 6 घंटे की एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे डालने की अनुमति देकर अंडे संग्रह को प्रतिबंधित करें।
- 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से भरे व्यंजन कुओं को विच्छेदन में लार्वा ले लीजिए।
- प्रत्येक लार्वा के लिए, बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 10 माइक्रोनल 1x पीबीएस और एक साफ विच्छेदन पैड पर 10 माइक्रोल 1x पीबीएस रखें। विच्छेदन पैड को एक प्रबुद्ध स्टीरियोमाइक्रोस्कोप बेस पर रखें।
- विच्छेदन पैड पर पीबीएस ड्रॉप में स्थानांतरित करने से पहले इसे ऊतक पोंछ पर रखकर एक व्यक्तिगत लार्वा को सुखा लें।
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, धीरे खुले आंसू और ध्यान से हीमोलिम्फ जारी करने के लिए क्यूटिकल उलटा ।
नोट: ध्यान रखें कि क्यूटिकल को कुरेदने या प्रहार न करें क्योंकि यह संभावित रूप से सेसाइल हीमोसाइट्स जारी कर सकता है। - एक पिपेट का उपयोग करके, विच्छेदन पैड से हीमोलिम्फ इकट्ठा करें। वसा शरीर जैसे लार्वा मलबे को इकट्ठा करने से बचें।
- एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में हीमोलिम्फ जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
नोट: कई नमूनों को एक बार में एकत्र किया जा सकता है और एक घंटे तक बर्फ पर रखा जा सकता है। - वैकल्पिक: डाई और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए बराबर भागों में हीमोलिम्फ नमूने के साथ ट्रिपैन ब्लू मिलाएं। ट्रिपन ब्लू जोड़ने के 3 मिनट के भीतर कोशिकाओं की गणना करें क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त है।
- एक हीमोसाइटोमीटर कक्ष में 10 माइक्रोन लोड करने से पहले ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा नमूना मिलाएं।
- यदि स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर रहे हैं, तो सेल आकार और परिपत्रता के लिए उचित पैरामीटर सेट करें। उदाहरण के लिए, सामान्य, गोल हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए 2 माइक्रोन का न्यूनतम सेल आकार, 22 माइक्रोन का अधिकतम सेल आकार और 75 - 80% गोलाई की गोलाकारता निर्धारित करें। बड़े और धुरी के आकार के हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए विभिन्न मापदंडों के साथ प्रयोग करें, जैसे कि लैमेलोसाइट्स। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से हीमोसाइट्स गिनने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |