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Encyclopedia of Experiments

क्यूटिकल व्यवधान: ड्रोसोफिला लार्वा से हीमोलिम्फ एकत्र करने की एक विधि

Overview

ड्रोसोफिला हीमोलिमिम्फ लार्वा और वयस्क चरणों के दौरान पूरे शरीर में घूम रहा है, रक्त और मध्यवर्ती तरल पदार्थ दोनों के रूप में कार्य करता है। यह वीडियो परिसंचारी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए लार्वा हीमोलिम्फ एकत्र करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल रेमेल्स और फलेगर से एक अंश है, ड्रोसोफिला लार्वा, जे विस एक्सपी (2016) में लिम्फ ग्रंथि और हीमोसाइट्स की जांच करने के तरीके।

1. परिसंचारी हीमोसाइट एकाग्रता

  1. इस परख के लिए लगभग एक ही विकासात्मक चरण के लार्वा प्राप्त करने के लिए, महिलाओं को 2 - 6 घंटे की एक निश्चित समय अवधि के लिए अंडे डालने की अनुमति देकर अंडे संग्रह को प्रतिबंधित करें।
  2. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) से भरे व्यंजन कुओं को विच्छेदन में लार्वा ले लीजिए।
  3. प्रत्येक लार्वा के लिए, बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 10 माइक्रोनल 1x पीबीएस और एक साफ विच्छेदन पैड पर 10 माइक्रोल 1x पीबीएस रखें। विच्छेदन पैड को एक प्रबुद्ध स्टीरियोमाइक्रोस्कोप बेस पर रखें।
  4. विच्छेदन पैड पर पीबीएस ड्रॉप में स्थानांतरित करने से पहले इसे ऊतक पोंछ पर रखकर एक व्यक्तिगत लार्वा को सुखा लें।
  5. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, धीरे खुले आंसू और ध्यान से हीमोलिम्फ जारी करने के लिए क्यूटिकल उलटा ।
    नोट: ध्यान रखें कि क्यूटिकल को कुरेदने या प्रहार न करें क्योंकि यह संभावित रूप से सेसाइल हीमोसाइट्स जारी कर सकता है।
  6. एक पिपेट का उपयोग करके, विच्छेदन पैड से हीमोलिम्फ इकट्ठा करें। वसा शरीर जैसे लार्वा मलबे को इकट्ठा करने से बचें।
  7. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में हीमोलिम्फ जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
    नोट: कई नमूनों को एक बार में एकत्र किया जा सकता है और एक घंटे तक बर्फ पर रखा जा सकता है।
  8. वैकल्पिक: डाई और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए बराबर भागों में हीमोलिम्फ नमूने के साथ ट्रिपैन ब्लू मिलाएं। ट्रिपन ब्लू जोड़ने के 3 मिनट के भीतर कोशिकाओं की गणना करें क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त है।
  9. एक हीमोसाइटोमीटर कक्ष में 10 माइक्रोन लोड करने से पहले ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा नमूना मिलाएं।
  10. यदि स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर रहे हैं, तो सेल आकार और परिपत्रता के लिए उचित पैरामीटर सेट करें। उदाहरण के लिए, सामान्य, गोल हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए 2 माइक्रोन का न्यूनतम सेल आकार, 22 माइक्रोन का अधिकतम सेल आकार और 75 - 80% गोलाई की गोलाकारता निर्धारित करें। बड़े और धुरी के आकार के हीमोसाइट्स का पता लगाने के लिए विभिन्न मापदंडों के साथ प्रयोग करें, जैसे कि लैमेलोसाइट्स। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से हीमोसाइट्स गिनने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS tablets MP Biomedicals 2810305
dissecting dish Corning 7220-85
microcentrifuge tube Denville C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit Krayden (distributed through Fisher) NC9644388 (Fisher catalog number) Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope Morrell Instruments (Nikon distributor) mna42000, mma36300 Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe VWR 82003-820
forceps Electron Microscopy Sciences 72700-DZ
p200 pipette Eppendorf 3120000054
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
hemocytometer Hausser Scientific 3200
trypan blue stain Life Technologies T10282

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क्यूटिकल व्यवधान: <em>ड्रोसोफिला</em> लार्वा से हीमोलिम्फ एकत्र करने की एक विधि
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स्रोत: रीमेल्स, टी ए और फलेगर, सी.M ड्रोसोफिला लार्वा में लिम्फ ग्रंथि और हीमोसाइट्स की जांच करने के तरीके। जे विस एक्सप्रेस। (2016).

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