Overview
L'emolinfa Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante la larva e le fasi adulte. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Reimels e Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp.
1. Concentrazione di emociti circolanti
- Per ottenere larve di circa lo stesso stadio di sviluppo per questo saggio, limitare la raccolta delle uova consentendo alle femmine di deporre le uova per un periodo di tempo fisso di 2 - 6 ore.
- Raccogliere le larve nei pozzi di sezionatura dei piatti riempiti con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Per ogni larva, posizionare 10 μl 1x PBS in un tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e 10 μl 1x PBS su un cuscinetto di sezionamento pulito. Posizionare la sezionatura su una base stereomicroscopica illuminata.
- Asciugare una singola larva posizionandolo su una salvietta tissutale prima di trasferirla in una goccia PBS sulla pastiglia di dissezione.
- Usando un paio di forcep, apri delicatamente e inverti con cura la cuticola per rilasciare l'emolinfa.
NOTA: Fare attenzione a non raschiare o colpire la cuticola in quanto ciò potrebbe potenzialmente rilasciare emociti sessili. - Usando una pipetta, raccogliere l'emolinfa dal pad di sezionazione. Evitare di raccogliere detriti larvali come il corpo grasso.
- Aggiungere l'emolinfa a un tubo di microcentrifugo e mescolare pipettando su e giù.
NOTA: Diversi campioni possono essere raccolti contemporaneamente e tenuti sul ghiaccio per un massimo di un'ora. - Facoltativo: mescolare il blu trypan con il campione di emolinfa in parti uguali per tingere ed escludere le cellule morte. Contare le cellule entro 3 minuti dall'aggiunta di trypan blu perché è tossico per le cellule.
- Mescolare il campione tubazione su e giù prima di caricare 10 μl in una camera emocitometrica.
- Se si utilizza un contatore di celle automatico, impostare i parametri appropriati per la dimensione e la circolarità delle celle. Ad esempio, impostare una dimensione minima della cella di 2 μm, una dimensione massima della cella di 22 μm e una circolarità del 75-80% di rotondità per rilevare emociti normali e rotondi. Sperimenta diversi parametri per rilevare emociti più grandi e a forma di mandrino, come i lamellociti. In alternativa, utilizzare un emocitometro per contare manualmente gli emociti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
