Overview
Drosophila 혈몰리프는 유충과 성인 단계 도중 바디를 통해 순환하는 혈액과 간질 액체 둘 다 역합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 애벌레 혈청을 수집하는 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
이 프로토콜은 레이멜스와 Pfleger에서 발췌, 드로소필라 애벌레에서 림프선과 혈구를 검사하는 방법, J. Vis. Exp. (2016).
1. 순환 혈구 농도
- 이 분석기에 대해 대략 동일한 발달 단계의 애벌레를 얻으려면 여성이 2 - 6 시간의 고정 된 기간 동안 계란을 낳을 수 있도록하여 계란 수집을 제한하십시오.
- 1x 인산완충식식(PBS)으로 채워진 해부 접시 우물에서 애벌레를 채운다.
- 각 유충에 대해 10 μl 1x PBS를 얼음 위에 미세 센심분리기 튜브에, 깨끗한 해부 패드에 10 μl 1x PBS를 놓습니다. 해부 패드를 조명된 스테레오현미경 베이스에 놓습니다.
- 해부 패드에 PBS 드롭으로 전송하기 전에 조직 닦아에 배치하여 개별 애벌레를 건조.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 부드럽게 찢어서 큐티클을 조심스럽게 반전하여 혈모 림프를 방출합니다.
참고: 이 잠재적으로 sessile 혈구를 해제 할 수 있기 때문에 큐티클을 긁거나 jab하지 않도록주의하십시오. - 파이프를 사용하여 해부 패드에서 혈몰림프를 수집합니다. 지방 체와 같은 애벌레 파편을 수집하지 마십시오.
- 혈굴림프를 미세원심분리기 튜브에 넣고 위아래로 피펫을 섞어 섞습니다.
참고: 여러 샘플을 한 번에 수집하고 최대 1 시간 동안 얼음에 보관 할 수 있습니다. - 선택 사항: 트라이팬 블루를 동일한 부분으로 혈몰리프 샘플과 혼합하여 염색하고 죽은 세포를 제외합니다. 세포에 독성이 있기 때문에 Trypan blue를 추가한 3분 이내에 셀을 계산합니다.
- 10 μl을 혈류계 챔버에 적재하기 전에 위아래로 파이프팅하여 샘플을 섞습니다.
- 자동화된 셀 카운터를 사용하는 경우 셀 크기 및 순환에 적합한 매개 변수를 설정합니다. 예를 들어, 최소 셀 크기 2 μm, 최대 셀 크기 22 μm 및 75 -80% 원등도를 설정하여 정상, 둥근 혈전을 감지합니다. 다양한 매개 변수를 실험하여 라멜로세포와 같은 더 크고 스핀들 모양의 혈구를 감지합니다. 또는 혈세포계를 사용하여 혈구를 수동으로 계산하십시오.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |