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Encyclopedia of Experiments

큐티클 중단 : 드로소필라 애벌레에서 혈전을 수집하는 방법

Overview

Drosophila 혈몰리프는 유충과 성인 단계 도중 바디를 통해 순환하는 혈액과 간질 액체 둘 다 역합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 애벌레 혈청을 수집하는 프로토콜을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 레이멜스와 Pfleger에서 발췌, 드로소필라 애벌레에서 림프선과 혈구를 검사하는 방법, J. Vis. Exp. (2016).

1. 순환 혈구 농도

  1. 이 분석기에 대해 대략 동일한 발달 단계의 애벌레를 얻으려면 여성이 2 - 6 시간의 고정 된 기간 동안 계란을 낳을 수 있도록하여 계란 수집을 제한하십시오.
  2. 1x 인산완충식식(PBS)으로 채워진 해부 접시 우물에서 애벌레를 채운다.
  3. 각 유충에 대해 10 μl 1x PBS를 얼음 위에 미세 센심분리기 튜브에, 깨끗한 해부 패드에 10 μl 1x PBS를 놓습니다. 해부 패드를 조명된 스테레오현미경 베이스에 놓습니다.
  4. 해부 패드에 PBS 드롭으로 전송하기 전에 조직 닦아에 배치하여 개별 애벌레를 건조.
  5. 한 쌍의 집게를 사용하여 부드럽게 찢어서 큐티클을 조심스럽게 반전하여 혈모 림프를 방출합니다.
    참고: 이 잠재적으로 sessile 혈구를 해제 할 수 있기 때문에 큐티클을 긁거나 jab하지 않도록주의하십시오.
  6. 파이프를 사용하여 해부 패드에서 혈몰림프를 수집합니다. 지방 체와 같은 애벌레 파편을 수집하지 마십시오.
  7. 혈굴림프를 미세원심분리기 튜브에 넣고 위아래로 피펫을 섞어 섞습니다.
    참고: 여러 샘플을 한 번에 수집하고 최대 1 시간 동안 얼음에 보관 할 수 있습니다.
  8. 선택 사항: 트라이팬 블루를 동일한 부분으로 혈몰리프 샘플과 혼합하여 염색하고 죽은 세포를 제외합니다. 세포에 독성이 있기 때문에 Trypan blue를 추가한 3분 이내에 셀을 계산합니다.
  9. 10 μl을 혈류계 챔버에 적재하기 전에 위아래로 파이프팅하여 샘플을 섞습니다.
  10. 자동화된 셀 카운터를 사용하는 경우 셀 크기 및 순환에 적합한 매개 변수를 설정합니다. 예를 들어, 최소 셀 크기 2 μm, 최대 셀 크기 22 μm 및 75 -80% 원등도를 설정하여 정상, 둥근 혈전을 감지합니다. 다양한 매개 변수를 실험하여 라멜로세포와 같은 더 크고 스핀들 모양의 혈구를 감지합니다. 또는 혈세포계를 사용하여 혈구를 수동으로 계산하십시오.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS tablets MP Biomedicals 2810305
dissecting dish Corning 7220-85
microcentrifuge tube Denville C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit Krayden (distributed through Fisher) NC9644388 (Fisher catalog number) Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope Morrell Instruments (Nikon distributor) mna42000, mma36300 Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe VWR 82003-820
forceps Electron Microscopy Sciences 72700-DZ
p200 pipette Eppendorf 3120000054
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
hemocytometer Hausser Scientific 3200
trypan blue stain Life Technologies T10282

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큐티클 중단 : <em>드로소필라</em> 애벌레에서 혈전을 수집하는 방법
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출처: 레이멜스, T. A. 및 Pfleger, C.M. 드로소필라 애벌레의 림프선과 혈구를 검사하는 방법. J. 비스 익스펙. (2016).

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