Overview
Гемолимфа Drosophila служит как кровь и интерстициальная жидкость, циркулирующих по всему телу во время личинки и взрослых этапов. Это видео описывает протокол для сбора личинок гемолимф для того, чтобы количественно циркулирующих клеток.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Реймельса и Пфлегер, Методы изучения лимфатических желез и гемоцитов в Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Концентрация циркулирующих гемоцитов
- Чтобы получить личинки примерно такой же стадии развития для этого анализа, ограничить сбор яйцеклеток, позволяя женщинам откладывать яйца в течение фиксированного периода времени 2 - 6 часов.
- Сбор личинок в вскрытии блюдо колодцы заполнены 1x фосфат буфера солевого раствора (PBS).
- Для каждой личинки поместите 10 МКл 1x PBS в микроцентрифуг трубки на льду и 10 йл 1x PBS на чистой вскрытой площадке. Поместите вскрытую площадку на подсвеченную стереомикроскопную основу.
- Высушите индивидуальную личинку, поместив ее на салфетку ткани перед передачей ее в pbs падение на вскрытии площадку.
- Используя пару типсов, аккуратно разорвать и тщательно инвертировать кутикулу, чтобы освободить гемолимфа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы не царапать или удар кутикулы, как это потенциально может освободить sessile гемоцитов. - Используя пипетку, соберите гемолимфу из вскрытой площадки. Избегайте сбора личинок мусора, таких как жир тела.
- Добавить гемолимф в микроцентрифуг трубки и перемешать, трубчатые вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно собрать сразу несколько образцов и хранить на льду до часа. - Дополнительно: Смешайте trypan синий с образцом гемолимфа в равных частях, чтобы покрасить и исключить мертвые клетки. Подсчитайте клетки в пределах 3 минут добавления Trypan синий, потому что это токсично для клеток.
- Смешайте образец, трубя вверх и вниз перед загрузкой 10 мкл в гемоцитометр камеры.
- При использовании автоматизированного счетчика ячеек установите соответствующие параметры размера ячейки и круговорота. Например, установить минимальный размер клетки 2 мкм, максимальный размер клетки 22 мкм, и круговая 75 - 80% округлость для обнаружения нормальных, круглых гемоцитов. Экспериментируйте с различными параметрами для обнаружения крупных и шпиндельообразных гемоцитов, таких как ламеллоциты. Кроме того, используйте гемоцитометр для ручного подсчета гемоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
