Overview
Drosophila hemolimf, larva ve yetişkin aşamalarında vücutta dolaşan hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür. Bu videoda, dolaşımdaki hücreleri ölçmek için larva hemolimfini toplamak için bir protokol açıklanmaktadır.
Protocol
Bu protokol Reimels ve Pfleger'den bir alıntıdır, Drosophila Larvalarında Lenf Bezi ve Hemositleri İnceleme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2016).
1. Dolaşımdaki Hemosit Konsantrasyonu
- Bu test için kabaca aynı gelişim aşamasında larva elde etmek için, dişilerin 2 - 6 saatlik sabit bir süre boyunca yumurta bırakmasına izin vererek yumurta toplamayı kısıtlayın.
- Larvaları 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile dolu diseksiyon kabı kuyularında toplayın.
- Her larva için, buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpüne 10 μl 1x PBS ve temiz bir diseksiyon pedi üzerine 10 μl 1x PBS yerleştirin. Diseksiyon pedi ışıklı bir stereomikroskop tabanına yerleştirin.
- Diseksiyon pedi üzerindeki pbs damlasına aktarmadan önce bir doku mendiline yerleştirerek tek bir larva kurutun.
- Bir çift yaban arısı kullanarak, yavaşça yırtın ve hemolimfi serbest bırakmak için manisi dikkatlice ters çevirin.
NOT: Sessile hemositlerini potansiyel olarak serbest bırakabileceği için lütikül kazımamaya veya yumruklamamaya dikkat edin. - Bir pipet kullanarak, hemolimf'i diseksiyon pedinizden toplayın. Yağ gövdesi gibi larva kalıntılarını toplamaktan kaçının.
- Hemolimf'i bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın.
NOT: Aynı anda birkaç örnek toplanabilir ve bir saate kadar buzda tutulabilir. - İsteğe bağlı: Trypan mavisini hemolimf örneğiyle eşit parçalarda karıştırarak ölü hücreleri boyayın ve hariç tutun. Hücreler için toksik olduğu için Trypan mavisi eklemeden sonraki 3 dakika içinde hücreleri sayın.
- Bir hemositometre odasına 10 μl yüklemeden önce numuneyi yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
- Otomatik hücre sayacı kullanıyorsanız, hücre boyutu ve döngüsellik için uygun parametreleri ayarlayın. Örneğin, normal, yuvarlak hemositleri tespit etmek için minimum 2 μm hücre boyutu, maksimum 22 μm hücre boyutu ve % 75 - 80 yuvarlaklık daireselliği ayarlayın. Lamellositler gibi daha büyük ve mil şeklindeki hemositleri tespit etmek için farklı parametrelerle denemeler yapın. Alternatif olarak, hemositleri manuel olarak saymak için bir hemositometre kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 |
