Overview
ड्रोसोफिला उड़ान मांसपेशियों का उपयोग मांसपेशियों के विकास और शरीर विज्ञान के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में किया जाता है। यह वीडियो वयस्कों की उड़ान मांसपेशी का वर्णन करता है और अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों को विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पर प्रकाश डालता है जो प्यूप से आरएनए अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं।
Protocol
यह प्रोटोकॉल काओ एट अलसे एक अंश है, ओमिक्स दृष्टिकोण, जे विस एक्सपी के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर उड़ान मांसपेशियों का विच्छेदन। (2019).
1. 48 घंटे के बाद आईएफएम विच्छेदन
- दो #5 जीव विज्ञान ग्रेड संदंश, ठीक कैंची, मानक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड, डबल स्टिक टेप, पिपेट, पिपेट टिप्स, सूखी बर्फ, और (आरएनए अनुप्रयोगों के लिए) अलगाव अभिकर् पंगा (सामग्री की तालिकादेखें) सहित आवश्यक उपकरण इकट्ठा करें। बर्फ पर 1x पीबीएस और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को ठंडा करें।
- हल्के से गीले तूलिका का उपयोग करके, मंचन प्यूप को माइक्रोस्कोप स्लाइड(चित्रा 1ए)पर चढ़कर दो तरफा चिपचिपा टेप की एक पट्टी में स्थानांतरित करें। एक लाइन में पिल्ला रखें, एक ही अभिविन्यास में उन्मुख (स्लाइड के नीचे की ओर वेंट्रल डाउन और पूर्वकाल)।
नोट: सावधान रहें कि तूलिका या फिल्टर पर बहुत अधिक पानी का उपयोग न करें, या प्यूप अच्छी तरह से नहीं चिपकेगी। यदि पिल्ले चिपक नहीं जाते हैं, तो उन्हें पहले सूखे फिल्टर या ऊतक पेपर में स्थानांतरित करके सुखा लें। माउंट के रूप में कई pupae के रूप में एक 30 मिनट समय खिड़की के भीतर विच्छेदित किया जा सकता है, आदर्श ~10 pupae । - पुपल मामले से पिल्ला निकालें। अलग चिढ़ाने और पूर्वकाल सर्पिल(चित्रा 1बी)के ऊपर पुपल मामले को खोलने के लिए संदंश का उपयोग करें ।
- धीरे-धीरे पीछे की ओर डॉरसली संदंश की एक जोड़ी स्लाइड करें, पुपल मामले को काटते हुए जैसे कि संदंश चाल(चित्रा 1बी')। अंतर्निहित पिल्ला को टूटना न हो, सावधान रहें। पिल्ला को खोले गए मामले से मुक्त करें और तुरंत इसे दूसरे माइक्रोस्कोप स्लाइड (चित्रा 1बी",सी)पर1xपीबीएस की एक बूंद में स्थानांतरित करें।
- लाइन में सभी पिल्ले के लिए चरण 1.3 और 1.4 दोहराएं, फिर डबल-स्टिक टेप स्लाइड को अलग सेट करें।
- ठीक कैंची का उपयोग करते हुए, प्यूपा के पेट को छाती से दूर काट लें और इसे एक अलग ढेर(चित्रा 1डी, डी'में धकेल दें।) । शेष पिल्ले के लिए दोहराएं।
नोट: जैसे ही पुपल अखंडता बाधित होती है, स्टेप 1.6 के साथ विच्छेदन की लंबाई का समय शुरू करें। सेल मृत्यु और संबंधित ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटेओमिक परिवर्तनों को रोकने के लिए 20-30 मिनट में जितना संभव हो उतने मक्खियों को विच्छेदन करें। 1 डी वयस्कों या >90 h pupae को विच्छेदन करते समय, अक्सर बाद के चरणों के लिए ठीक कैंची के साथ सिर को हटाने के लिए सुविधाजनक होता है। - एक ऊतक कागज का उपयोग करना, 1x PBS के बहुमत को हटा दें (आम तौर पर निलंबित वसा के साथ बादल छाए रहेंगे) के साथ-साथ पेट के ढेर(चित्रा 1ई)। शेष छाती में ताजा, ठंडा 1x पीबीएस की एक बूंद जोड़ें।
- एक ही गति में देशांतर शरीर धुरी के नीचे सिर से काटने के द्वारा आधे में छाती(चित्रा 1एफ, एफ'काटने के लिए कैंची का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, यदि सिर हटा दिया गया है, तो पहले कैंची डालें जहां सिर जुड़ा हुआ था और आईएफएम के बीच छाती के ऊपरी आधे हिस्से को काट दें। फिर, एक ही अभिविन्यास में दूसरी कटौती के साथ छाती के वेंट्रल साइड को काटें।
- सभी पिल्ले को विच्छेदित करने के लिए चरण 1.7 और 1.8 दोहराएं, स्लाइड के केंद्र के पास छाती के हेमिसेक्शन का ढेर पैदा करें। सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर पर्याप्त ठंडा 1x पीबीएस है ताकि हेमीस्लेक्शन सूख न जाए।
नोट: ४८ एच एपीएफ के बाद, आईएफएम काफी बड़े होते हैं जो प्रशिक्षित आंखों को एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देते हैं । प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, फ्लोरोसेंट लेबल वाली मांसपेशियों को आईएफएम पहचान में सहायता करने या प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए फ्लोरोसेंट विच्छेदन गुंजाइश में ले जाया जा सकता है, लेकिन यह आवश्यक नहीं है। - आईएफएम को छाती से बाहर निकालें। #5 संदंश(चित्रा 1जी, एच)का उपयोग करके एक हेमिस्ेक्शन को अलग करें। धीरे-धीरे आईएफएम(चित्रा 1जी', एच'के बीच में और नीचे एक संदंश के सुझाव डालें।) । पहले संदंश को अभी भी पकड़े हुए, आईएफएम के एक छोर को क्यूटिकल और टेंडन से दूर काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें। फिर, आईएफएम के दूसरे छोर को क्यूटिकल(चित्रा 1जी', एच')से मुक्त करें।
नोट: पहले आईएफएम कट के बाद छाती के अभिविन्यास के आधार पर, छाती को 180° घुमाना उपयोगी है ताकि दूसरा आईएफएम कट प्रदर्शन करना आसान हो। - संप से छाती से IFM बंडल निकालें(चित्रा 1G', H''',यह PBS बुलबुले के किनारे करने के लिए पानी के तनाव का उपयोग करने के लिए यह जगह में पकड़(चित्रा 1मैं)। स्लाइड के विपरीत दिशा में शव पुश करें। शेष छाती हेमिस्ेक्शन के लिए दोहराएं, विच्छेदित आईएफएम का संग्रह उत्पन्न करें।
नोट: अगर आईएफएम साफ-सुथरे ढेर में नहीं रहते हैं तो 1x पीबीएस में से कुछ को टिश्यू से हटा दें। सावधान रहें कि सभी पीबीएस वाष्पित न हों, और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित आईएफएम और हेमिटोराक्स बफर द्वारा कवर किए जाएं। - सभी IFMs विच्छेदन के बाद, जल्दी से विच्छेदित मांसपेशियों पर एक गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करते हैं। #5 संदंश का उपयोग करना, किसी भी कूद मांसपेशी या cuticle टुकड़े है कि नमूना में अपना रास्ता मिल सकता है हटा दें(चित्रा 1जे'''।
नोट: कूद मांसपेशी IFM से अलग दिखाई देता है। यदि फ्लोरेसेंस के तहत Mef2-Gal4 लेबल मांसपेशी विच्छेदन, कूद मांसपेशी एक कमजोर फ्लोरेसेंस और एक अलग आकार और बनावट है । सामान्य प्रकाश के तहत, यह लगभग पारदर्शी प्रतीत होता है, जबकि IFMs एक अपारदर्शी, दूधिया पीला(चित्रा 1J-J',K)हैं । - पानी के तनाव का उपयोग करना, संदंश(चित्रा 1एल)के बीच विच्छेदित IFMs को कैप्चर (लेकिन स्क्वैश न करें) । आईएफएम को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें 250 माइक्रो-भरा ठंडा 1x पीबीएस(चित्रा 1एम)है। धारा 2 के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
नोट: जब संदंश युक्तियां एक दूसरे की निकटता में लाया जाता है और एक बफर समाधान से बाहर उठा लिया जाता है, तो पानी के तनाव के कारण बफर का बुलबुला संदंश युक्तियों के बीच कब्जा कर लिया जाता है। यदि आईएफएम भी इस बुलबुले में मौजूद हैं, तो उन्हें समाधान से बाहर निकाला जा सकता है और आसानी से एक और बफर-भरे गोदाम में स्थानांतरित किया जा सकता है। बफर बुलबुले में पकड़े गए ऊतकों को छूने से बचने के लिए, एक दूसरे को छूने के बिना एक दूसरे के पास सुझाव लाने के लिए संदंश को निचोड़ना महत्वपूर्ण है।
2. गोली और IFM नमूना संरक्षित
- एक टेबल-टॉप सेंट्रलाइज (चित्रा 2ए, बी)में 2,000 एक्स ग्राम पर 3-5 मिनट के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को अपकेंद्रित्र करके आईएफएम को गोली मारदें।
- एक पिपेट टिप(चित्रा 2सी)का उपयोग करके बफर निकालें।
- आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, वांछित आरएनए आइसोलेशन बफर के 50-100 माइक्रोल में आईएफएम गोली को फिर से खर्च करें (सामग्री की तालिकादेखें, चित्रा 2डी)। अन्यथा, 2.4 कदम आगे बढ़ें।
नोट: आईएफएम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री तैयारी या वाणिज्यिक किट के साथ आरएनए के अलगाव के लिए चरण 2.2 के बाद शुष्क-जमे हुए हो सकते हैं (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, बेहतर परिणाम तुरंत पुनर्व्यवसित करके प्राप्त किए जाते हैं और आइसोलेशन बफर में आईएफएम गोली को ठंडा करते हैं। - तरल नाइट्रोजन(चित्रा 2ई)में सूखी बर्फ या स्नैप फ्रीज पर नमूना फ्रीज करें। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी में बाद के चरणों के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद, नमूनों को डाउनस्ट्रीम जांच के लिए प्रसंस्करण से पहले कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
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Representative Results
चित्र 1: 48 घंटे के बाद आईएमएस का विच्छेदन। (ए)डबल-स्टिक टेप पर प्यूप का संरेखण। (ख)पुनः खोलने से पुपल मामले से पिल्ले को हटाना, मामले को काटकर(बी),और पिल्ला(बी')को हटाना। सर्कल प्रतीकों ने चित्र 2के समान प्रतिनिधित्व किया । (ग)पवे का बफर में स्थानांतरण। (घ)कैंची (पीले दोहरे तीर) से काटकर पेट को हटाना और छाती से अलग होना(डी))। (ई,एफ) स्वच्छ बफर(ई)के अलावा, तो आधा longitudinally(एफ, एफ'में छाती की काटने । (जी,एच) विच्छेदन जीएफपी(एच)की कल्पना करने के लिए सफेद प्रकाश(जी)या फ्लोरेसेंस के तहत किया जा सकता है; एक तरफ आईएफएम की कटिंग(जी'),तो दूसरी तरफ(जी'); संदंश के साथ छाती से बाहर उठाने (ग्रे में उल्लिखित)(जी')। (I, J,K) बफर(I)में आईएफएम का संग्रह और एक स्वच्छ आईएफएम नमूना(के)उत्पन्न करने के लिए दूषित वेंट्रल नर्व कॉर्ड (वीएनसी), आंत, और कूद मांसपेशी (टीडीटी)(जे)को हटाना। टीडीटी में कम जीएफपी अभिव्यक्ति है और आईएफएम फाइबर(J'', K') कीतुलना में एक अलग आकार है। (एल,एम) आईएफएम(एल)को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब(एम)में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। स्केल बार = 1 सेमी (ए, ई, एम), 1 मिमी (बी-डी,एफ-एल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: IFM संरक्षण और आरएनए अलगाव विवरण। (A) आईएफएम को 2000 x ग्राम पर 5 मिनट तक सेंट्रलाइज करके गोली मार दी जाती है. (B)आईएफएम गोली (तीर) और फ्लोरेसेंस के तहत गोली(बी)। (ग)एक पिपेट टिप के साथ सभी बफर को हटाना। (घ)आरएनए निष्कर्षण के लिए, आइसोलेशन बफर में गोली का पुनर्पितरण। इस कदम को ड्राई-फ्रीज विच्छेदित आईएफएम के लिए छोड़ दिया जा सकता है । (ई)तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ और भंडारण पर -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की ठंड। स्केल बार = 10 सेमी (ए), 1 मिमी (बी,बी'), 1 सेमी (सी, डी, ई)। (एफ)विच्छेदित आईएफएम से कुल आरएनए के नैनोग्राम (एनजी) 16 घंटे APF, 24 एच एपीएफ, 30 एच एपीएफ, ४८ एच एपीएफ, ७२ एच एपीएफ, ९० एच एपीएफ, और 1 डी वयस्क पर प्रति फ्लाई प्राप्त । त्रुटि सलाखों = एसडी (जी)कुल आरएनए आईएफएम से अलग ५० 1 डी वयस्क मक्खियों से अलग निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर । त्रुटि सलाखों = SD.(एच)प्रतिनिधि विभिन्न निष्कर्षण तरीकों के बाद परख आरएनए अखंडता के लिए निशान। रिबोसोमल बैंड 2000 न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) और मार्कर बैंड के ठीक नीचे 25 एनटी पर चलते हैं। पूरक चित्रा 1में अतिरिक्त निशान उपलब्ध है । (I)एक हौसले से अलग आरएनए नमूना (शीर्ष), एक नमूना फ्रीज-सूखी बर्फ (दूसरे भूखंड), एक नमूना बेंच (तीसरे भूखंड) पर 4 घंटे के लिए छोड़ दिया पर 25x गल के प्रतिनिधि निशान, और एक नमूना RNase ए (नीचे साजिश) के साथ इलाज किया । ब्रू 1 और rp49के लिए लेबल के रूप में किट से RNase ए(जे)आरटी पीसीआर जेल के अलावा आरएनए की पूरी गिरावट ध्यान दें । rp49 के खिलाफ सामान्यीकृत ब्रू 1 बैंड की सापेक्ष तीव्रता नीचे प्लॉट की गई है। त्रुटि सलाखों = SEM (unpaired टीपरीक्षण, पी = 0.0119) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 1. (A,B,C) आरएनए एक ही सप्ताह में एक ही शोधकर्ता द्वारा विच्छेदित एक ही जीनोटाइप के नमूनों से पैदावार । सभी नमूनों के विच्छेदन के बाद, आरएनए को अलग-थलग कर दिया गया और उसी दिन मापा गया । (A)कुल आरएनए का नैनोग्राम (एनजी) आईएफएम विच्छेदन प्रति 1 डी वयस्क फ्लाई से प्राप्त किया जाता है । त्रुटि सलाखों = SEM.(B)कुल आरएनए 30 घंटे APF, ४८ एच APF, ७२ एच APF और 1 डी वयस्क पर विच्छेदित IFM प्रति फ्लाई से प्राप्त की । (ग)आईएफएम से अलग कुल आरएनए विभिन्न निष्कर्षण विधियों का उपयोग करके 50 1 डी वयस्क मक्खियों से विच्छेदित। (घ)विच्छेदित पैरों, जंप मांसपेशी (टीडीटी) और आईआईएफएम से प्रति फ्लाई कुल आरएनए सांद्रता । अधिक आरएनए बड़े आईएफएम से प्राप्त किया जाता है। त्रुटि सलाखों = एसडी(ई)आईएफएम की फ्लाई प्रति कुल आरएनए सांद्रता 30 घंटे APF, ७२ एच APF और 1 डी वयस्क पर आरएनएआई या उत्परिवर्ती नमूनों की तुलना में नियंत्रण से विच्छेदित । म्यूटेंट के लिए, डब्ल्यू1118 का उपयोग वाइल्डटाइप नियंत्रण के रूप में किया जाता था। उत्परिवर्ती डेटा bru1-IR, साल्म-/-और एक और आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन उत्परिवर्ती से संकलित कर रहे हैं । ध्यान दें कि इन जोड़तोड़ के लिए, मांसपेशियों की शोष और हानि के कारण 1 डी वयस्क में आरएनए की पैदावार में कमी आई है, इसलिए अधिक मक्खियों को ओमिक्स दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विच्छेदित करने की आवश्यकता होती है। त्रुटियां सलाखों = एसडी (एफ)अतिरिक्त चित्रा 2G में दिखाया आरएनए अलगाव तरीकों के लिए आरएनए अखंडता दिखा निशान और सीमें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
