دروسوفيلا في فيفو تصوير الكالسيوم: طريقة للتصوير الوظيفي لنشاط الخلايا العصبية

Overview

يصف هذا الفيديو في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الخلايا العصبية Drosophila باستخدام GCaMP. مقطع بروتوكول واردة يوضح كيفية تسجيل التغيرات في مضان GCaMP من الخلايا العصبية الجسم الفطر خلال تجربة تكييف الشم.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من هانكوك وآخرون ،في تصوير الكالسيوم البصريفي فيفو لللدونة المتشابكة الناجمة عن التعلم في Drosophila melanogaster ، J. Vis. Exp. (2019). 

1. في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي

1. استخدم مجهرا متعدد الفوتون مجهزا بالليزر بالأشعة تحت الحمراء وهدف غمر الماء (انظر جدول المواد)، مثبتا على طاولة معزولة عن الاهتزاز. لتصور مؤشرات الكالسيوم المستندة إلى GFP ، قم بضبط الليزر على طول موجي مثير يبلغ 920 نانومتر وتثبيت فلتر تمرير نطاق GFP.
2. باستخدام مقبض التكيف Z الخشنة، والمسح الضوئي من خلال محور Z من الدماغ وتحديد موقع منطقة الدماغ من الفائدة. استخدم وظيفة الاقتصاص للتركيز على المسح الضوئي على هذه المنطقة فقط لتقليل وقت المسح الضوئي، وتدوير عرض المسح الضوئي بحيث يواجه الجزء الأمامي من الرأس لأسفل.
3. ضبط حجم الإطار إلى 512 × 512 بكسل، وسرعة المسح الضوئي إلى > 4 هرتز، ومسح المنطقة (في البعد ص) بحيث يتم تغطية الخلايا العصبية ذات الاهتمام.

2. التصور من العابرين الكالسيوم رائحة أثار من خلال تكييف الشم

1. استخدم نظام توصيل الرائحة الذي يمكنه تقديم العديد من محفزات الرائحة بطريقة دقيقة زمنيا.
   1. استخدم جهاز كمبيوتر إضافي للتحكم في الجهاز، وللتواصل مع برنامج مجهر التصوير لتنسيق تحفيز الرائحة مع التقاط الصور أثناء التجارب.
   2. بدء حزمة ماكرو مبرمجة مسبقا قادرة على ربط برنامج اقتناء الصور وبرنامج تسليم الرائحة (على سبيل المثال، حزمة ماكرو VBA المثبتة في برنامج التحكم المجهر، انظر جدول المواد) التي تستجيب لمشغل الإدخال الخارجي التي تقدمها بدء بروتوكول تسليم رائحة في برنامج منفصل).
2. بدء القياس من خلال رصد "ما قبل التدريب" / السذاجة رائحة أثار عابري الكالسيوم في قرار من 512 × 512 بكسل ومعدل الإطار من 4 هرتز. تقديم 2.5 ثانية رائحة التحفيز يحيط بها الحصول على صورة إضافية ل6.25 ق بداية الرائحة السابقة (لتحديد قيمة خط الأساس F₀₎ و 12.5 ثانية بعد تعويض الرائحة. كرر هذا مع رائحة ثانية ثم مع رائحة ثالثة.
3. مواصلة 3 دقائق بعد هذا القياس مع تكييف الكلاسيكية ("التدريب") ذبابة.
   1. حدد واحدة من الروائح المقدمة في مرحلة "ما قبل التدريب" لتصبح CS⁺ رائحة وآخر لتصبح CS^- رائحة. تقديم CS^{+ رائحة} باستخدام الكمبيوتر التي تسيطر عليها رائحة تسليم النظام لمدة 60 ق جنبا إلى جنب مع اثني عشر 90 V الصدمات الكهربائية.
   2. بعد استراحة 60 ق، وتقديم CS^- رائحة وحدها لمدة 60 s. استخدام الروائح 4-ميثيلسيكلوهيكسانول و 3-أوكتانول. لا تقدم الرائحة الثالثة (على سبيل المثال، 1-octen-3-ol) أثناء هذا التدريب حيث يتم استخدامها كتحكم فقط قبل (الخطوة 2.2.) وبعد (الخطوة 2.4) مرحلة التدريب.
4. قياس "ما بعد التدريب" رائحة أثار عابري الكالسيوم مرة أخرى عن طريق تكرار "ما قبل التدريب" بروتوكول تحفيز الرائحة (الخطوة 2.2.) 3 دقيقة بعد الانتهاء من مرحلة التدريب (الخطوة 2.3).
   ملاحظة: توقيت هذه الخطوة يجب أن تعكس وقت الاهتمام بعد تشكيل الذاكرة (على سبيل المثال، تنفيذ هذه الخطوة 3-4 دقيقة بعد خطوة تكييف للتحقيق في الذاكرة على المدى القصير). عادة، الذباب يمكن البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات في هذا الإعداد.
5. حفظ ملفات التصوير في شكل مناسب (على سبيل المثال، Tiff) لتحليل الصورة في وقت لاحق.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.