ショウジョウバエインビボ カルシウムイメージング:神経活動の機能的イメージング法

Overview

このビデオは、GCaMPを用いたショウジョウバエニューロンにおける生体内カルシウムイメージングについて説明する。注目のプロトコルクリップは、嗅覚調節実験中にキノコの体ニューロンからのGCaMP蛍光の変化を記録する方法を示しています。

Protocol

このプロトコルは、ハンコックらからの抜粋です,学習誘発シナプス可塑性のインビボ光学カルシウムイメージング, ショウジョウバエメラノガスター, J. Vis. Exp. (2019). 

1. 生体内カルシウムイメージング

1. 赤外線レーザーと水浸漬目的( 材料表を参照)を備えた多光子顕微鏡を振動分離テーブルに取り付けて使用します。GFP ベースのカルシウムインジケーターを視覚化するには、レーザーを 920 nm の励起波長に調整し、GFP バンド パス フィルターを取り付けます。
2. 粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、関心のある脳領域を見つけます。この領域のみをスキャンしてスキャン時間を最小限にし、頭の前部が下向きになるようにスキャンビューを回転させるには、crop関数を使用します。
3. フレームサイズを512 x 512 px、スキャン速度を>4 Hzに調整し、対象ニューロンがカバーされるように領域(Y次元)をスキャンします。

2. 嗅覚調節による臭気誘発カルシウム過渡性の可視化

1. 時間的に精密な方法で、いくつかの臭い刺激を提供することができる臭気の供給システムを使用してください。
   1. デバイスを制御するために追加のコンピュータを使用し、イメージング顕微鏡ソフトウェアと通信して、実験中に画像キャプチャと臭気刺激を調整します。
   2. 画像取得ソフトウェアと匂い配信プログラムをリンクできる事前にプログラムされたマクロパッケージを開始します (例えば、顕微鏡制御ソフトウェアにインストールされたVBAマクロパッケージは、 材料表を参照してください)。
2. 512 x 512 pxの解像度で「プレトレーニング」/ナイーブ臭誘発カルシウム過渡を監視し、4 Hzのフレームレートで測定を開始します。これを2番目の臭気で繰り返し、3番目の臭気で繰り返します。
3. この測定の3分後に、古典的なコンディショニング(「トレーニング」)フライを続けます。
   1. CS+臭いとなる「事前トレーニング」段階で提示された臭いの1つを選択し、もう1つは^CS-臭いになります。コンピュータ制御の臭気供給システムを使用してCS⁺臭いを1290Vの電気ショックとともに60sに提示します。
   2. 60sの休憩の後、CS^- 60 sの単独の臭いを提示する。臭気剤として使用 4-メチルシクロヘキサノールと 3-オクタノール.このトレーニングでは、トレーニング段階の前(ステップ2.2.2)および後(ステップ2.4)の制御としてのみ使用されるため、第3の臭気剤(例えば、1-オクテン-3-ol)を提示しないでください。
4. トレーニングフェーズを終了した後に「事前トレーニング」臭気刺激プロトコル(ステップ2.2.)を3分繰り返して、再び「後トレーニング」臭気誘発カルシウム過渡を測定します(ステップ2.3)。
   注: このステップのタイミングは、メモリ形成後の対象時間を反映する必要があります(例えば、短期記憶を調査するためにコンディショニングステップの後にこのステップ3〜4分を実行する)。通常、ハエはこの準備で数時間生き残ることができます。
5. 後で画像解析を行うために、適切な形式(TIFF など)でイメージングファイルを保存します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.