Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung der neuronalen Aktivität

Overview

Dieses Video beschreibt in vivo Kalzium-Bildgebung in Drosophila Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie man Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufzeichnet.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. In vivo Calcium-Bildgebung

1. Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Infrarotlaser und einem Wassertauchobjektiv (siehe Tabelle der Materialien)ausgestattet ist, das auf einem vibrationsisolierten Tisch installiert ist. Für die Visualisierung von GFP-basierten Calciumindikatoren stimmen Sie den Laser auf eine Anregungswellenlänge von 920 nm ab und installieren Sie einen GFP-Bandpassfilter.
2. Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die von Interesse sindde Hirnregion. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um das Scannen nur auf diesen Bereich zu konzentrieren, um die Scanzeit zu minimieren, und um die Scanansicht so zu drehen, dass der Vorderkopf nach unten zeigt.
3. Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px, die Scangeschwindigkeit auf > 4 Hz und den Scanbereich (in der Y-Dimension) an, sodass die neuronen von Interesse abgedeckt werden.

2. Visualisierung geruchsbeschworener Calciumtransienten durch olfaktorische Konditionierung

1. Verwenden Sie ein Geruchsabgabesystem, das zeitlich präzise mehrere Geruchsreize liefern kann.
   1. Verwenden Sie einen zusätzlichen Computer, um das Gerät zu steuern, und um mit der Bildmikroskop-Software zu kommunizieren, um Geruchsstimulationen mit Bildaufnahme während Experimenten zu koordinieren.
   2. Initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das die Bildaufnahmesoftware mit dem Geruchslieferprogramm verbinden kann (z. B. ein in der Mikroskopsteuerungssoftware installiertes VBA-Makropaket, siehe Tabelle der Materialien), das auf einen externen Eingabeauslöser reagiert, der durch die Initiierung eines Geruchslieferprotokolls in einem separaten Programm bereitgestellt wird).
2. Beginnen Sie die Messung mit einer Messung durch Überwachung von "Pre-Training"/naiven geruchsbeschworenen Calciumtransienten mit einer Auflösung von 512 x 512 px und einer Bildrate von 4 Hz. Liefern Sie einen 2,5 s Geruchsreiz, flankiert durch zusätzliche Bildaufnahme für 6,25 s vorausgehenden Geruchsbeginn (um einen F 0-Basiswert zu ermitteln) und 12,5 s nach Geruchskompensation. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Geruchsmittel und dann mit einem dritten Geruchsmittel.
3. Fahren Sie 3 min nach dieser Messung mit klassischer Konditionierung ("Training") der Fliege fort.
   1. Wählen Sie einen der Gerüche in der "Pre-Training" Phase präsentiert, um die CS⁺ Geruch und eine andere, um die CS^- Geruch zu werden. Präsentieren Sie den CS⁺ Geruch mit dem computergesteuerten Geruchsliefersystem für 60 s neben zwölf 90 V Elektroschocks.
   2. Nach einer 60 s Pause, präsentieren Sie die CS^- Geruch allein für 60 s. Als Geruchsstoffe 4-Methylcyclohexanol und 3-Oktanol verwenden. Stellen Sie das dritte Geruchsmittel (z.B. 1-Okten-3-ol) während dieses Trainings nicht vor (Schritt 2.2.) und nach (Schritt 2.4) der Trainingsphase als Kontrolle dar.
4. Messen Sie die "nach dem Training" geruchsbeschworenen Kalziumtransienten erneut, indem Sie das "Pre-Training"-Geruchsstimulationsprotokoll (Schritt 2.2.) 3 min nach Abschluss der Trainingsphase wiederholen (Schritt 2.3).
   HINWEIS: Der Zeitpunkt dieses Schritts sollte die Zeit des Interesses nach der Gedächtnisbildung widerspiegeln (z.B. diesen Schritt 3-4 min nach dem Konditionierungsschritt durchführen, um das Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen). In der Regel können Fliegen in dieser Zubereitung mehrere Stunden überleben.
5. Speichern Sie Bildgebungsdateien in einem geeigneten Format (z. B. Tiff) für eine spätere Bildanalyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.