דרוזופילה בויו הדמיית סידן: שיטה להדמיה תפקודית של פעילות עצבית

Overview

וידאו זה מתאר הדמיית סידן vivo בנוירונים Drosophila באמצעות GCaMP. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לתעד שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP של נוירונים בגוף פטריות במהלך ניסוי מיזוג חוש הריח.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך הנקוק ואח ', ב Vivo אופטי סידן הדמיה של פלסטיקה סינפטית הנגרמת על ידי למידה ב Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. בהדמיית סידן vivo

1. השתמש במיקרוסקופ מולטי פוטון המצויד בלייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים (ראה טבלת חומרים), המותקנת על שולחן מבודד רטט. להדמיה של מחווני סידן מבוססי GFP, כוונן את הלייזר לאורך גל עירור של 920 ננומטר והתקן מסנן מעבר פס GFP.
2. בעזרת ידית ההתאמה הגסה Z, יש לסרוק דרך ציר Z של המוח ולאתר את אזור העניין במוח. השתמש בפונקציית החיתוך כדי למקד את הסריקה באזור זה בלבד כדי למזער את זמן הסריקה, ולסובב את תצוגת הסריקה כך שהקצה הקדמי של הראש פונה כלפי מטה.
3. התאם את גודל המסגרת ל- 512 x 512 px, סרוק מהירות ל- > 4 הרץ וסרוק אזור (בממד Y) כך שהנוירונים המעניינים יכסו.

2. הדמיה של סידן מעורר ריח חולף באמצעות מיזוג חוש הריח

1. השתמש במערכת אספקת ריח שיכולה לספק מספר גירויים ריח באופן מדויק זמנית.
   1. השתמש במחשב נוסף כדי לשלוט בהתקן, ולתקשר עם תוכנת מיקרוסקופ ההדמיה כדי לתאם גירויי ריח עם לכידת תמונה במהלך ניסויים.
   2. התחל חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר בין תוכנת רכישת התמונה לבין תוכנית מסירת הריח (למשל, חבילת מאקרו VBA המותקנת בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, ראה טבלת חומרים) המגיבה לגורם מפעיל חיצוני של קלט המסופק על-ידי אתחול פרוטוקול מסירת ריח בתוכנית נפרדת).
2. התחל את המדידה על-ידי ניטור "טרום אימון"/תעוזה של סידן מעורר ריח ברזולוציה של 512 x 512 px וקצב פריימים של 4 הרץ. ספק גירוי ריח של 2.5 שניות מוקף ברכישת תמונה נוספת עבור 6.25 s תחילת ריח קודמת (כדי לקבוע ערך בסיסי F₀₎ ו 12.5 s לאחר קיזוז ריח. חזור על זה עם ריח שני ולאחר מכן עם ריח שלישי.
3. המשך 3 דקות לאחר מדידה זו עם מיזוג קלאסי ("אימון") לטוס.
   1. בחר אחד הריחות המוצגים בשלב "טרום אימון" כדי להפוך את CS⁺ ריח ועוד להיות CS^- ריח. הצג את CS⁺ ריח באמצעות מערכת העברת ריח מבוקרת מחשב עבור 60 s לצד שנים עשר 90 V מכות חשמל.
   2. לאחר הפסקה של 60 שניות, להציג את CS^- ריח לבד במשך 60 s. יש להשתמש בתור ריחות 4-מתיל-צ'יקלוהקסנול ו-3-אוקטנול. אין להציג את הריח השלישי (למשל, 1-octen-3-ol) במהלך אימון זה כפי שהוא משמש כשליטה רק לפני (שלב 2.2.) ואחרי (שלב 2.4) שלב האימון.
4. למדוד את "לאחר אימון" ריח מעורר סידן חולף שוב על ידי חזרה על "אימון מקדים" פרוטוקול גירוי ריח (שלב 2.2.) 3 דקות לאחר סיום שלב האימון (שלב 2.3).
   שים לב: העיתוי של שלב זה צריך לשקף את זמן העניין לאחר היווצרות הזיכרון (למשל, לבצע את השלב הזה 3-4 דקות לאחר שלב ההתניה כדי לחקור זיכרון לטווח קצר). בדרך כלל, זבובים יכולים לשרוד במשך כמה שעות בהכנה זו.
5. שמור קבצי דימות בתבנית מתאימה (לדוגמה, Tiff) לניתוח תמונה מאוחר יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.