Overview
यह वीडियो GCaMP का उपयोग कर ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स में वीवो कैल्शियम इमेजिंग में वर्णन करता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल क्लिप से पता चलता है कि कैसे एक घ्राण कंडीशनिंग प्रयोग के दौरान मशरूम शरीर न्यूरॉन्स से GCaMP फ्लोरेसेंस में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए ।
Protocol
यह प्रोटोकॉल हैनकॉक एट अल से एक अंश है, वीवो ऑप्टिकल कैल्शियम इमेजिंग ऑफ लर्निंग-प्रेरित सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर, जे विस एक्सप्रेस (2019)।
1. वीवो कैल्शियम इमेजिंग में
- एक अवरक्त लेजर और एक पानी विसर्जन उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें), एक कंपन अलग मेज पर स्थापित के साथ सुसज्जित एक मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। जीएफपी-आधारित कैल्शियम संकेतकों के दृश्य के लिए, लेजर को 920 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य में ट्यून करें और जीएफपी बैंड-पास फ़िल्टर स्थापित करें।
- मोटे जेड समायोजन घुंडी का उपयोग करना, मस्तिष्क की जेड धुरी के माध्यम से स्कैन और ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र का पता लगाने। स्कैन समय को कम करने के लिए केवल इस क्षेत्र पर स्कैनिंग ध्यान केंद्रित करने के लिए फसल फ़ंक्शन का उपयोग करें, और स्कैन दृश्य को घुमाने के लिए जैसे कि सिर का पूर्वकाल नीचे की ओर सामना कर रहा है।
- फ्रेम आकार को 512 x 512 पीसी, स्कैन गति से और 4 हर्ट्ज, और स्कैन क्षेत्र (वाई आयाम में) को समायोजित करें ताकि ब्याज के न्यूरॉन्स कवर किए जा सकें।
2. घ्राण कंडीशनिंग के माध्यम से गंध पैदा कैल्शियम यात्रियों का दृश्य
- एक गंध वितरण प्रणाली का उपयोग करें जो कई गंध उत्तेजनाओं को अस्थायी सटीक तरीके से वितरित कर सकता है।
- डिवाइस को नियंत्रित करने के लिए एक अतिरिक्त कंप्यूटर का उपयोग करें, और प्रयोगों के दौरान छवि कैप्चर के साथ गंध उत्तेजनाओं का समन्वय करने के लिए इमेजिंग माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ संवाद करने के लिए।
- छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और गंध वितरण कार्यक्रम (उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्थापित एक वीबीए मैक्रो पैकेज, सामग्री की तालिकादेखें) को जोड़ने में सक्षम एक पूर्व-प्रोग्राम किए गए मैक्रो पैकेज शुरू करें जो एक अलग कार्यक्रम में गंध वितरण प्रोटोकॉल की शुरुआत द्वारा प्रदान किए गए बाहरी इनपुट ट्रिगर के प्रति उत्तरदायी है)।
- 512 x 512 पीसी के संकल्प पर "प्री-ट्रेनिंग" /भोली गंध-पैदा कैल्शियम यात्रियों और 4 हर्ट्ज की फ्रेम दर पर माप शुरू करें। 6.25 एस पूर्ववर्ती गंध शुरुआत (एफ0 बेसलाइन मूल्य स्थापित करने के लिए) और गंध ऑफसेट के बाद 12.5 एस एस के लिए अतिरिक्त छवि अधिग्रहण द्वारा फ्लैंक किए गए 2.5 एस गंध उत्तेजना को वितरित करें। इसे एक दूसरे गंध के साथ और फिर एक तिहाई गंध के साथ दोहराएं।
- शास्त्रीय कंडीशनिंग ("प्रशिक्षण") मक्खी के साथ इस माप के बाद 3 मिनट जारी रखें।
- सीएस+ गंध बनने के लिए "पूर्व-प्रशिक्षण" चरण में प्रस्तुत गंध में से एक का चयन करें और दूसरा सीएस- गंध बनने के लिए। बारह 90 वी इलेक्ट्रिक झटके के साथ 60 एस के लिए कंप्यूटर नियंत्रित गंध-उद्धार प्रणाली का उपयोग करके सीएस+ गंध प्रस्तुत करें।
- एक 60 एस ब्रेक के बाद, सीएस पेशकरें - 60 एस के लिए अकेले गंध। गंध 4-मिथाइलसाइक्लोओएक्सेनोल और 3-ऑक्टानॉल के रूप में उपयोग करें। इस प्रशिक्षण के दौरान तीसरे गंध (जैसे, 1-ऑक्टेन-3-ओलिंपिक्स) पेश न करें क्योंकि इसका उपयोग केवल नियंत्रण के रूप में (चरण 2.2.) से पहले और प्रशिक्षण चरण (चरण 2.4) के बाद किया जाता है।
- प्रशिक्षण चरण (चरण 2.3) को खत्म करने के बाद "प्रशिक्षण के बाद" गंध-पैदा किए गए कैल्शियम क्षणिकों को फिर से "पूर्व-प्रशिक्षण" गंध उत्तेजना प्रोटोकॉल (चरण 2.2.) 3 मिनट दोहराकर मापें।
नोट: इस चरण के समय स्मृति गठन के बाद ब्याज के समय को प्रतिबिंबित करना चाहिए (उदाहरण के लिए, अल्पकालिक स्मृति की जांच करने के लिए कंडीशनिंग चरण के बाद इस चरण को 3-4 मिनट तक ले जाना)। आमतौर पर, मक्खियों इस तैयारी में कई घंटों तक जीवित रह सकते हैं। - बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त प्रारूप (जैसे, झगड़ा) में इमेजिंग फ़ाइलों को सहेजें।
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope | Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |