Overview
이 비디오는 GCaMP를 사용하여 Drosophila 뉴런에서 생체 내 칼슘 이미징에서 설명합니다. 추천 프로토콜 클립 후각 컨디셔닝 실험 중 버섯 신체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 핸콕 외에서 발췌, 드로소필라 멜라노가스터에서 학습 유도 시냅스 가소성의생체 내 광학 칼슘 이미징, J. Vis. Exp. (2019).
1. 생체 내 칼슘 이미징
- 적외선 레이저와 진동 격리 테이블에 설치된 물 침지 목표(재료 표참조)가 장착된 다광 현미경을 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 레이저를 920 nm의 난분 파장에 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다.
- 거친 Z 조절 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하고 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간을 최소화하고 헤드의 전방이 아래쪽으로 향하도록 스캔 보기를 회전시키기 위해 이 영역에만 스캐닝에 초점을 맞춥니다.
- 프레임 크기를 512 x 512 px로 조정하고, 속도를 > 4Hz로 스캔하고, 관심 있는 뉴런이 덮여 있도록 영역(Y 치수)을 스캔합니다.
2. 후각 컨디셔닝을 통해 악취를 불러일으킨 칼슘 과도의 시각화
- 여러 가지 악취 자극을 적시에 정확하게 전달할 수 있는 악취 전달 시스템을 사용하십시오.
- 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중에 이미지 캡처와 냄새 자극을 조정합니다.
- 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 재료 표참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하여 별도의 프로그램에서 악취 전달 프로토콜을 개시하여 제공하는 외부 입력 트리거에 반응합니다.
- 512 x 512 px의 해상도와 4Hz의 프레임 속도로 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도를 모니터링하여 측정을 시작합니다. 두 번째 냄새와 다음 세 번째 냄새와 함께이것을 반복합니다.
- 이 측정 후 3분 동안 계속 하여 클래식 컨디셔닝("트레이닝")을 비행합니다.
- "사전 훈련" 단계에서 제시된 냄새 중 하나를 선택하여 CS+ 냄새가 되고 다른 하나는 CS- 냄새가 됩니다. 12 90 V 감전과 함께 60s용 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 CS+ 악취를 제시합니다.
- 60 s 휴식 후, CS를 제시- 60 s에 대한 혼자 냄새. 오취제 4-메틸시클로헥사놀과 3-옥타놀로 사용하십시오. 훈련 단계(2.2.) 및 후(2.4단계) 전에만 제어로 사용되기 때문에 본 훈련 중에 제3 악취(예를 들어, 1-옥텐-3-ol)를 제시하지 마십시오.
- "사전 훈련" 악취 자극 프로토콜(단계 2.2.) 훈련 단계(단계 2.3)를 완료한 후 3분 동안 반복하여 "훈련 후" 악취 유발 칼슘 과도를 다시 측정한다.
참고: 이 단계의 타이밍은 메모리 형성 후 관심의 시간을 반영해야 한다(예: 단기 메모리를 조사하기 위한 컨디셔닝 단계 후 3-4분 후에 이 단계를 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 살아남을 수 있습니다. - 이미징 파일을 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장하여 이후 이미지 분석을 제공합니다.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope | Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |