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Encyclopedia of Experiments

드로소필라 인 비보 칼슘 이미징: 신경 활동의 기능적 이미징 방법

Overview

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 Drosophila 뉴런에서 생체 내 칼슘 이미징에서 설명합니다. 추천 프로토콜 클립 후각 컨디셔닝 실험 중 버섯 신체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 핸콕 외에서 발췌, 드로소필라 멜라노가스터에서 학습 유도 시냅스 가소성의생체 내 광학 칼슘 이미징, J. Vis. Exp. (2019). 

1. 생체 내 칼슘 이미징

  1. 적외선 레이저와 진동 격리 테이블에 설치된 물 침지 목표(재료 참조)가 장착된 다광 현미경을 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 레이저를 920 nm의 난분 파장에 조정하고 GFP 대역 통과 필터를 설치합니다.
  2. 거친 Z 조절 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하고 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간을 최소화하고 헤드의 전방이 아래쪽으로 향하도록 스캔 보기를 회전시키기 위해 이 영역에만 스캐닝에 초점을 맞춥니다.
  3. 프레임 크기를 512 x 512 px로 조정하고, 속도를 > 4Hz로 스캔하고, 관심 있는 뉴런이 덮여 있도록 영역(Y 치수)을 스캔합니다.

2. 후각 컨디셔닝을 통해 악취를 불러일으킨 칼슘 과도의 시각화

  1. 여러 가지 악취 자극을 적시에 정확하게 전달할 수 있는 악취 전달 시스템을 사용하십시오.
    1. 추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중에 이미지 캡처와 냄새 자극을 조정합니다.
    2. 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 재료 표참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하여 별도의 프로그램에서 악취 전달 프로토콜을 개시하여 제공하는 외부 입력 트리거에 반응합니다.
  2. 512 x 512 px의 해상도와 4Hz의 프레임 속도로 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도를 모니터링하여 측정을 시작합니다. 두 번째 냄새와 다음 세 번째 냄새와 함께이것을 반복합니다.
  3. 이 측정 후 3분 동안 계속 하여 클래식 컨디셔닝("트레이닝")을 비행합니다.
    1. "사전 훈련" 단계에서 제시된 냄새 중 하나를 선택하여 CS+ 냄새가 되고 다른 하나는 CS- 냄새가 됩니다. 12 90 V 감전과 함께 60s용 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 CS+ 악취를 제시합니다.
    2. 60 s 휴식 후, CS를 제시- 60 s에 대한 혼자 냄새. 오취제 4-메틸시클로헥사놀과 3-옥타놀로 사용하십시오. 훈련 단계(2.2.) 및 후(2.4단계) 전에만 제어로 사용되기 때문에 본 훈련 중에 제3 악취(예를 들어, 1-옥텐-3-ol)를 제시하지 마십시오.
  4. "사전 훈련" 악취 자극 프로토콜(단계 2.2.) 훈련 단계(단계 2.3)를 완료한 후 3분 동안 반복하여 "훈련 후" 악취 유발 칼슘 과도를 다시 측정한다.
    참고: 이 단계의 타이밍은 메모리 형성 후 관심의 시간을 반영해야 한다(예: 단기 메모리를 조사하기 위한 컨디셔닝 단계 후 3-4분 후에 이 단계를 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 살아남을 수 있습니다.
  5. 이미징 파일을 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장하여 이후 이미지 분석을 제공합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope Custom-written and available upon request n.a. n.a.

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