Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntüleme Yöntemi

Overview

Bu video, GCaMP kullanan Drosophila nöronlarında in vivo kalsiyum görüntülemeyi açıklar. Öne çıkan protokol klibi, koku alma şartlandırma deneyi sırasında mantar vücut nöronlarından GCaMP floresanındaki değişikliklerin nasıl kaydedildiğini gösterir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019)'da Öğrenme Kaynaklı Sinaptik PlastisiteninIn Vivo Optik Kalsiyum Görüntülemesinden bir alıntıdır. 

1. In vivo kalsiyum görüntüleme

1. Titreşimle izole edilmiş bir masaya monte edilmiş kızılötesi lazer ve su daldırma hedefi (bkz. Malzeme Tablosu)ile donatılmış çok sesli bir mikroskop kullanın. GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için lazeri 920 nm'lik bir uyarlama dalga boyuna ayarlayın ve bir GFP bant geçiş filtresi takın.
2. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak, beynin Z eksenini tarayın ve ilgi çekici beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca bu alana odaklamak ve tarama görünümünü başın ön kısmı aşağı bakacak şekilde döndürmek için kırpma işlevini kullanın.
3. Çerçeve boyutunu 512 x 512 piksele, tarama hızını > 4 Hz'e ve tarama bölgesini (Y boyutunda) yapın, böylece ilgi çekici nöronlar kapsanır.

2. Koku çağrılan kalsiyum geçicilerinin koku şartlandırması yoluyla görselleştirilmesi

1. Zamansal olarak hassas bir şekilde çeşitli koku uyaranları sunabilen bir koku dağıtım sistemi kullanın.
   1. Cihazı kontrol etmek ve deneyler sırasında koku stimülasyonlarını görüntü yakalama ile koordine etmek için görüntüleme mikroskobu yazılımıyla iletişim kurmak için ek bir bilgisayar kullanın.
   2. Ayrı bir programda koku dağıtım protokolünün başlatılmasıyla sağlanan harici bir giriş tetikleyicisine yanıt veren görüntü alma yazılımını ve koku dağıtım programını (örneğin, mikroskop kontrol yazılımına yüklenmiş bir VBA makro paketi, bkz. Malzeme Tablosu)bağlayabilen önceden programlanmış bir makro paketi başlatın.
2. Ölçümü 512 x 512 px çözünürlükte ve 4 Hz kare hızında "ön eğitim"/naif koku uyandıran kalsiyum geçicilerini izleyerek başlatın. Bunu ikinci bir koku ile ve sonra üçüncü bir koku ile tekrarlayın.
3. Bu ölçümden 3 dakika sonra klasik koşullandırma ("eğitim") sinek ile devam edin.
   1. CS⁺ koku olmak için "ön eğitim" aşamasında sunulan kokulardan birini ve CS^- koku olmak için başka bir koku seçin. On iki 90 V elektrik şokunun yanı sıra 60 s için bilgisayar kontrollü koku teslim sistemini kullanarak CS⁺ kokuyu sunun.
   2. 60 s moladan sonra, CS'yi saın^- 60 s için tek başına koku. Odorant olarak kullanın 4-metilsiklopohexanol ve 3-octanol. Bu eğitim sırasında üçüncü kokuyu (örneğin, 1-sekizli-3-ol) sadece eğitim aşamasından önce (adım 2.2.) ve sonra (adım 2.4) kontrol olarak kullanıldığından sunmayın.
4. Eğitim aşamasını bitirdikten 3 dakika sonra (adım 2.3) "eğitim öncesi" koku stimülasyon protokolünü (adım 2.2.) tekrarlayarak "eğitim sonrası" koku uyandıran kalsiyum geçicilerini tekrar ölçün.
   NOT: Bu adımın zamanlaması, bellek oluşumundan sonraki ilgi süresini yansıtmalıdır (örneğin, kısa süreli belleği araştırmak için koşullandırma adımından 3-4 dakika sonra bu adımı gerçekleştirin). Tipik olarak, sinekler bu hazırlıkta birkaç saat hayatta kalabilir.
5. Görüntüleme dosyalarını daha sonraki görüntü analizi için uygun bir biçimde (örneğin, Tiff) kaydedin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.