Drosophila In Vivo Imágenes de calcio: Un método para la toma de imágenes funcionales de la actividad neuronal

Overview

Este video describe imágenes in vivo de calcio en neuronas de Drosophila usando GCaMP. El clip de protocolo destacado muestra cómo registrar los cambios en la fluorescencia GCaMP de las neuronas corporales de hongos durante un experimento de acondicionamiento olfativo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Imágenes in vivo de calcio

1. Utilice un microscopio multifotlón equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión en agua (véase Tabla de materiales),instalado en una mesa aislada por vibraciones. Para la visualización de indicadores de calcio basados en GFP, ajuste el láser a una longitud de onda de excitación de 920 nm e instale un filtro de paso de banda GFP.
2. Usando la perilla de ajuste Z gruesa, escanear a través del eje Z del cerebro y localizar la región cerebral de interés. Utilice la función de recorte para enfocar el escaneo solo en esta área para minimizar el tiempo de escaneo y para girar la vista de escaneado de forma que el anterior de la cabeza esté mirando hacia abajo.
3. Ajuste el tamaño del marco a 512 x 512 px, la velocidad de escaneo a > 4 Hz y la región de escaneo (en la dimensión Y) para que las neuronas de interés estén cubiertas.

2. Visualización de transitorios de calcio evocados por olores a través del acondicionamiento olfativo

1. Utilice un sistema de entrega de olores que pueda ofrecer varios estímulos de olor de una manera temporalmente precisa.
   1. Utilice un ordenador adicional para controlar el dispositivo y comunicarse con el software de microscopio de imágenes para coordinar las estimulaciones del olor con la captura de imágenes durante los experimentos.
   2. Inicie un paquete macro preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores (por ejemplo, un paquete macro VBA instalado en el software de control de microscopios, consulte Tabla de materiales)que responde a un disparador de entrada externo proporcionado por el inicio de un protocolo de entrega de olores en un programa independiente).
2. Comience la medición monitoreando los transitorios de calcio evocados por olores ingenuas a una resolución de 512 x 512 px y una velocidad de fotogramas de 4 Hz. Ofrezca un estímulo de olor de 2,5 s flanqueado por la adquisición de imágenes adicionales para un inicio de olor anterior de 6,25 s (para establecer un valor base F₀₎ y 12,5 s después del desplazamiento del olor. Repita esto con un segundo olor y luego con un tercer olor.
3. Continúe 3 minutos después de esta medición con el acondicionamiento clásico ("entrenamiento") la mosca.
   1. Seleccione uno de los olores presentados en la fase de "pre-entrenamiento" para convertirse en el olor CS⁺ y otro para convertirse en el CS^- olor. Presente el olor CS⁺ utilizando el sistema de entrega de olores controlado por ordenador durante 60 s junto con doce descargas eléctricas de 90 V.
   2. Después de un descanso de 60 s, presente el CS^- olor solo para 60 s. Úsalo como olores 4-metilcicloclohexanol y 3 octanol. No presente el tercer olor (por ejemplo, 1-octen-3-ol) durante este entrenamiento, ya que se utiliza como control sólo antes (paso 2.2.) y después (paso 2.4) de la fase de entrenamiento.
4. Mida de nuevo los transitorios de calcio evocados por olores "post-entrenamiento" repitiendo el protocolo de estimulación del olor "pre-entrenamiento" (paso 2.2.) 3 minutos después de terminar la fase de entrenamiento (paso 2.3).
   NOTA: El momento de este paso debe reflejar el tiempo de interés después de la formación de memoria (por ejemplo, llevar a cabo este paso 3-4 min después del paso de acondicionamiento para investigar la memoria a corto plazo). Por lo general, las moscas pueden sobrevivir durante varias horas en esta preparación.
5. Guarde los archivos de imágenes en un formato adecuado (por ejemplo, Tiff) para un análisis de imagen posterior.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.