Drosophila In Vivo Kalsiumavbildning: En metode for funksjonell avbildning av nevronaktivitet

Overview

Denne videoen beskriver in vivo kalsiumavbildning i Drosophila nevroner ved hjelp av GCaMP. Det utvalgte protokollklippet viser hvordan du registrerer endringer i GCaMP-fluorescens fra sopplegeme-nevroner under et olfaktorisk kondisjoneringseksperiment.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Hancock et al., In Vivo Optical Kalsium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. In vivo kalsiumavbildning

1. Bruk et multifotonmikroskop utstyrt med en infrarød laser og et vanninnlevelsesmål (se Materialfortegnelse), installert på et vibrasjonsisolert bord. For visualisering av GFP-baserte kalsiumindikatorer, juster laseren til en eksitasjonsbølgelengde på 920 nm og installer et GFP-båndpassfilter.
2. Bruk den grove Z-justeringsknappen til å skanne gjennom hjernens Z-akse og finne hjerneregionen av interesse. Bruk beskjæringsfunksjonen til å fokusere skanningen på bare dette området for å minimere skannetiden, og til å rotere skannevisningen slik at fremre hode vender nedover.
3. Juster rammestørrelsen til 512 x 512 piksler, skannehastigheten til > 4 Hz og skanneområdet (i Y-dimensjonen) slik at de interesserte nevronene dekkes.

2. Visualisering av lukt-fremkalte kalsium forbigående gjennom olfaktorisk kondisjonering

1. Bruk et luktleveringssystem som kan levere flere luktstimuli på en tidsmessig presis måte.
   1. Bruk en ekstra datamaskin til å kontrollere enheten, og til å kommunisere med bildemikroskopprogramvaren for å koordinere luktstimuleringer med bildeopptak under eksperimenter.
   2. Start en forhåndsprogrammert makropakke som kan koble bildeanskaffelsesprogramvaren og luktleveringsprogrammet (f.eks. en VBA-makropakke installert i mikroskopkontrollprogramvaren, se Materialfortegnelse) som svarer på en ekstern inngangsutløser levert ved oppstart av en luktleveringsprotokoll i et eget program).
2. Start målingen ved å overvåke "pre-trening"/naiv lukt-fremkalte kalsiumtransienter med en oppløsning på 512 x 512 piksler og en bildefrekvens på 4 Hz. Lever en luktanmulans på 2,5 s flankert av ytterligere bildeanskaffelse for 6,25 s foregående luktstart (for å etablere en F₀ baseline-verdi) og 12,5 s etter luktforskyvning. Gjenta dette med en annen luktstoff og deretter med en tredje luktstoff.
3. Fortsett 3 min etter denne målingen med klassisk kondisjonering ("trening") flyet.
   1. Velg en av luktene som presenteres i "pre-training" -fasen for å bli CS⁺ lukt og en annen for å bli CS^-lukten. Presenter CS⁺ lukten ved hjelp av det datastyrte luktleveringssystemet i 60 s sammen med tolv 90 V elektriske støt.
   2. Etter en pause på 60 s, presenter CS^- lukten alene i 60 s. Brukes som luktstoffer 4-metylcyklohexanol og 3-oktanol. Ikke presenter den tredje luktvæsken (f.eks. 1-okten-3-ol) under denne treningen, da den bare brukes som kontroll før (trinn 2.2.) og etter (trinn 2.4) treningsfasen.
4. Mål de "ettertrening" lukt-fremkalte kalsium forbigående igjen ved å gjenta "pre-trening" luktstimulering protokollen (trinn 2.2.) 3 min etter å ha fullført treningsfasen (trinn 2.3).
   MERK: Tidspunktet for dette trinnet bør gjenspeile tiden av interesse etter minnedannelse (f.eks. utføre dette trinnet 3-4 min etter kondisjoneringstrinnet for å undersøke kortsiktig minne). Vanligvis kan fluer overleve i flere timer i dette preparatet.
5. Lagre bildefiler i et passende format (f.eks. tiff) for senere bildeanalyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.