Summary
نقدم بروتوكولا للخلايا بكتيرية الانحناء الخيطية تعلق على سطح الغطاء للانزلاق مع اعتراض الضوئية لقياس صلابة الخلوية الانحناء.
Abstract
وضعنا بروتوكولا لقياس صلابة الانحناء من البكتيريا على شكل قضيب الخيطية. وتطبق القوات مع اعتراض البصرية ، وهي مجهرية ثلاثية الأبعاد الربيع مصنوع من الضوء الذي يتكون عندما تركز ليزر كثافة عالية شعاع لبقعة صغيرة جدا من عدسة المجهر وموضوعية. لثني خلية ، ونحن ربط first البكتيريا تعيش على ساترة كيميائيا المعاملة. وهذه الخلايا تنمو ، وسط الخلايا تظل ملزمة لساترة ولكن ينتهي المتزايد خالية من هذا التقييد. عن طريق حفز النمو الخيطية مع سيفاليكسين المخدرات ، ونحن قادرون على تحديد الخلايا التي كان عالقا في واحدة من نهاية الخلية إلى السطح في حين أن الطرف الآخر لا يزال غير مرتبط وعرضة لقوى الانحناء. ثم يتم تطبيق قوة الانحناء مع اعتراض الضوئية ملزمة حبة متعدد الليزين المغلفة لغيض من خلية المتنامية. وقد سجلت كل من القوة والتشريد من حبة وصلابة الانحناء من الخلية هو المنحدر من هذه العلاقة.
Protocol
- تنمو الخلايا كولاي في لوريا ، Beltrani المتوسطة (LB) مرق للتخلص الأسي (OD = 0،2-0،4).
- نمو الثقافة في LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من سيفاليكسين لمدة 15 دقيقة للحث على نمو الخيطية ، ومن ثم التركيز على ثقافة بنسبة 5 مرات خلال الطرد المركزي.
- جعل PEI المغلفة ساترة التي تتدفق polyethylenimine 1 ٪ المخفف في الماء في غرفة التدفق ، وتغسل بالماء بعد فترة حضانة المرض 5 دقائق.
- تدفق خلية ثقافة تتركز في الغرفة ، وغسلها مع خليط من LB وسيفاليكسين (50μg/mL) بعد 3 دقائق لإزالة الخلايا غير مرتبط.
- احتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة 1 ساعة للسماح للخلايا تنمو المرفقة قبل التنسيب على صك حصر البصرية.
- جعل متعدد الليزين المغلفة حبات الخرز التي يحتضنها البوليسترين 0.5 ميكرومتر القطر (الدوي مختبرات) في متعدد الليزين 0.1 ٪ المخفف في الماء لمدة 30 دقيقة. ثم تغسل حبات 3 مرات وresuspend في الماء.
- حبة تمييع الحل من قبل عامل من اثنين في LB مع سيفاليكسين (50μg/mL) ، وإضافته إلى غرفة التدفق.
- فخ بصريا حبة العائمة ومسها إلى الطرف الحر للخلية. (نحن نستخدم جنون مدينة المرحلة بيزو مختبرات للسيطرة على الحركة من العينة.) عندما تم العثور على مزيج مناسب حبة / خلية ، وغسل الغرفة مع سيفاليكسين في LB (50μg/mL) لإزالة الخرزات غير مرتبط.
- تشغيل مخصصة مكتوب LABVIEW برنامج لتطبيق قوى الانحناء إلى الخلية وتسجيل بيانات القوى التشريد. تفاصيل البرنامج
- معايرة استجابة كاشف النقطية مسح حبة المرفقة ضمن الكشف عن شعاع الليزر وتسجيل إشارات 3D الجهد PSD.
- تحديد محور الخلية طويلة في صورة المجهر.
- نقل الخلايا في الخطوات في اتجاه عمودي على محور الخلية الطويل.
- سجل المسافة نقل والتشريد من فخ البصرية.
- تحويل النزوح إلى القوة تطبيقها باستخدام قياس صلابة فخ التشرد سابقا وحفظ طرف والقوة لملف.
أسرار النجاح : في الخطوة 8) ، ويحتاج المرء للعثور على خلية مع نهاية محددة جيدا عالقا. عالقون في بعض الخلايا فقط طرف واحد ، وقوة الانحناء عند الطرف الآخر يؤدي إلى التمحور خلية كاملة بدلا من الانحناء. تم العثور على زوج مناسب عن طريق الانحناء بسرعة كل خلية من ناحية استخدام عصا التحكم في الحركة المرحلة التي تسيطر عليها.
ممثل النتائج :
الشكل 1. وهذا الرقم يبين قوة التشريد البيانات لخلية واحدة. المنحدر من هذا الخط هو صلابة الانحناء للخلية.
Discussion
ويهدف البروتوكول المقدمة هنا لقياس كمي لخصائص الثني من الخلايا البكتيرية. ويمكن تطبيق الإعداد لتجربة أي خلية على شكل قضيب التي يمكن تقديمها للنمو filamentously. وقد استخدمنا بنجاح هذا الإعداد لبحث الآثار المترتبة على شعيرات على صلابة هيكل الخلية الثني من E. القولونية الخلايا. ويمكن استخدام هذا الأسلوب نفسه لتقييم أدوار ، والضغط صلابة جدار الخلية داخل الخلايا ومكوناتها الأخرى في تحديد صلابة الانحناء عموما من الخلايا.
Disclosures
وقد رعت إنتاج الفيديو من هذه المادة من قبل مختبرات مدينة المجنون ، التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه الدراسات.
Acknowledgments
نعترف نصائح مفيدة من الشمس على الخلايا Mingzhai ملزمة لالسطوح. نشكر نيد Wingreen وغيتاي زيمر للمناقشات قيمة. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح P50GM07150 الوطني التوظيف جائزة مؤسسة العلوم PHY - 0844466 وP. ألفريد سلون مؤسسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
