Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zum Biegen filamentösen Bakterienzellen an eine Cover-Rutsch-Oberfläche mit einer optischen Falle auf die zelluläre Biegesteifigkeit zu messen.
Abstract
Wir entwickelten ein Protokoll, um die Biegesteifigkeit des filamentösen stäbchenförmige Bakterien zu messen. Kräfte werden mit einer optischen Falle, eine mikroskopisch kleine dreidimensionale Frühjahr aus Licht, die entsteht, wenn ein hoher Intensität Laserstrahl auf einen sehr kleinen Punkt wird durch ein Mikroskop das Ziel fokussiert angewendet wird. Zum Biegen einer Zelle, binden wir zuerst lebenden Bakterien zu einer chemisch behandelten Deckglas. Da diese Zellen wachsen, bleibt die Mitte der Zellen gebunden an das Deckglas, sondern die wachsende Enden sind frei von dieser Zurückhaltung. Durch die Induktion filamentösen Wachstums mit dem Medikament Cephalexin, sind wir in der Lage, Zellen, in denen ein Ende der Zelle an die Oberfläche geklebt wurde identifiziert, während das andere Ende blieb ungebunden und anfällig für Biegekräfte. Ein Biegekraft wird dann mit einer optischen Falle durch Bindung eines Polylysin-beschichtete Kügelchen an der Spitze einer wachsenden Zelle angewendet. Sowohl die Kraft und die Verschiebung der Kügelchen werden aufgezeichnet und die Biegesteifigkeit der Zelle ist die Steigung dieser Beziehung.
Protocol
- Wachsen E. coli-Zellen in Luria-Beltrani Brühe (LB)-Medium zu exponentiellen Phase (OD = 0.2-0.4).
- Die Kultur in LB mit 50 pg / ml Cephalexin für 15 min auf filamentösen Wachstum zu induzieren ergänzt, und dann konzentrieren sich die Kultur durch 5-mal durch Zentrifugation.
- Machen PEI-beschichteten Deckglas durch fließendes 1% Polyethylenimin in Wasser in einer Flusskammer verdünnt und mit Wasser waschen nach einer 5-minütigen Inkubation.
- Flow die konzentrierte Zellkultur in die Kammer, und wusch mit einer Mischung aus LB und Cephalexin (50μg/mL) nach 3 min zu losen Zellen zu entfernen.
- Inkubieren der Kammer bei 37 ° C für 30 min-1 Stunde, damit die anhaftenden Zellen wachsen, bevor sie auf die optische Fallen Instrument.
- Machen Polylysin-beschichteten Kügelchen durch Inkubation 0,5-um-Durchmesser Polystyrolkügelchen (Bangs Labs) in 0,1% Polylysin in Wasser für 30 min verdünnt. Dann waschen Sie die Perlen 3-mal und resuspendieren in Wasser.
- Verdünnen Sie die Bead-Lösung um den Faktor zwei in LB mit Cephalexin (50μg/mL), und fügen Sie ihn in die Strömungskammer.
- Optisch Falle einer schwimmenden Kügelchen, und tippen Sie auf die freie Spitze einer Zelle. (Wir verwenden ein Mad City Labs Piezo-Bühne, um der Bewegung der Probe zu kontrollieren.) Wenn ein geeigneter Perlen / Zell Kombination gefunden wird, waschen Sie die Kammer mit Cephalexin in LB (50μg/mL) zu losen Perlen zu entfernen.
- Run individuell geschriebenen LabView Programm Biegekräfte zu Zelle und nehmen Kraft-Weg-Daten gelten. Programmdetails
- Kalibrieren Detektor-Response durch Rastern der beigefügten Perle innerhalb der Detektionslaserstrahl und Aufzeichnung 3D PSD Spannungssignale.
- Identifizieren Zelle langen Achse in mikroskopischen Bild.
- Bewegen Zelle in Schritten in eine Richtung senkrecht zu der Zelle Längsachse.
- Notieren Sie sich die Wegstrecke und die Verschiebung von der optischen Falle.
- Convert Verschiebung nach Krafteinwirkung mit der zuvor gemessenen Falle Steifigkeit und sparen Spitze Vertreibung und Gewalt in eine Datei.
Secrets to Success: In Schritt 8), muss man eine Zelle mit einem gut definierten stecken Ende finden. Einige Zellen sind nur an einer Spitze, und die Biegekraft auf die andere Spitze stecken führt zu einer whole-cell schwenkbare anstatt Biegen. Ein geeignetes Paar ist durch Biegen jede Zelle schnell von Hand mit dem Joystick-gesteuerten Phase Bewegung gefunden.
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Diese Abbildung zeigt Kraft-Weg-Daten für eine einzelne Zelle. Die Steigung dieser Geraden ist die Biegesteifigkeit der Zelle.
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten dient zur quantitativen Messung der Biege-Eigenschaften von Bakterienzellen. Der Versuchsaufbau kann auf jeden stabförmigen Zelle, die aus bis filamentös wachsen kann angewendet werden. Wir haben dieses Setup verwendet, um die Auswirkungen der Filamente des Zytoskeletts auf die Biegesteifigkeit der E.-Sonde coli-Zellen. Die gleiche Technik kann verwendet werden, um die Rollen der Druck, Zellwand Steifigkeit und anderen intrazellulären Komponenten bei der Bestimmung insgesamt Biegesteifigkeit von Zellen zu evaluieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir erkennen an, hilfreiche Ratschläge von Mingzhai Sonne auf verbindliche Zellen an Oberflächen. Wir bedanken uns bei Ned Wingreen und Zemer Gitai für wertvolle Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren P50GM07150, National Science Foundation CAREER-Preis PHY-0844466 und der Alfred P. Sloan Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
