Summary
Biz hücresel bükülme sertliği ölçmek için bir optik tuzak bir kapak kayma yüzeyi bağlı bükme ipliksi bakteri hücreleri için bir protokol mevcut.
Abstract
Ipliksi çubuk şekilli bakteriler bükme sertliği ölçmek için bir protokol geliştirmiştir. Kuvvetleri, optik bir tuzak, bir yüksek yoğunluklu lazer ışını mikroskop objektif lens ile çok küçük bir noktaya odaklanmış oluşan ışık mikroskobik üç boyutlu bahar ile uygulanır. Bir hücre viraj için, öncelikle bir kimyasal işlem görmüş lamel canlı bakteri bağlama. Bu hücreler büyüdükçe, hücrelerin orta lamel bağlı kalır, ancak artan biter bu kısıtlama. Ilaç sefaleksin ile ipliksi büyümeyi teşvik ederek, diğer ucunu bükme güçleri unattached ve duyarlı kalırken hücrenin bir ucundan yüzeye yapışmış olan hücreler tespit edebilmek. Bükme kuvveti sonra büyüyen bir hücre ucu polylysine kaplı boncuk bağlayıcı bir optik tuzak ile uygulanır. Kuvvet ve boncuk yerinden her ikisi de kaydedilir ve hücre eğilme sertliği, bu ilişkinin eğimi.
Protocol
- Luria Beltrani suyu (LB) orta üstel faz (OD = 0.2-0.4), E. coli hücreleri büyütün.
- Ipliksi büyüme ikna etmek için 15 dakika süreyle 50 mcg / ml sefaleksin ile desteklenmiş LB kültür büyür ve sonra kültür santrifüj yoluyla 5 kez konsantre.
- % 1 polyethylenimine bir akış odasına su içinde seyreltilmesi akan PEI kaplı lamel olun ve 5 dakika inkübasyondan sonra su ile yıkayın.
- Odasına konsantre hücre kültürü akışı ve unattached hücreleri çıkarmak için 3 dakika sonra LB ve sefaleksin (50μg/mL) karışımı ile yıkanır.
- ° C 37 ° odasına inkübe bağlı hücreleri optik yakalama aracı yerleştirmeden önce büyümesine izin için 30 dakika-1 saat.
- 30 dakika su içinde seyreltilmesi% 0,1 polylysine 0,5 mikron çap polistiren boncuklar (Kaküller Labs) kuluçka polylysine kaplı boncuklar olun. Sonra boncuk, 3 kez yıkayın ve su tekrar süspansiyon haline getirin.
- Sefaleksin (50μg/mL) LB içine iki faktör tarafından boncuk çözeltinin ve akışını odasının içine ekleyin.
- Optik kayan boncuk tuzak ve bir hücrenin serbest ucu dokunma. (Örnek hareket kontrol Mad City Labs piezo sahne kullanın.) Uygun bir hücre / boncuk birleşimi bulunduğunda, LB (50μg/mL) unattached boncuk kaldırmak için odasına sefaleksin ile yıkayın.
- Hücre ve kayıt kuvvet-deplasman veri bükme güçleri uygulamak için özel yazılmış LabView programını çalıştırın. Program Ayrıntıları
- Raster algılama lazer ışını ve kayıt 3D PSD gerilim sinyalleri içinde ekli boncuk tarama dedektörü yanıt kalibre edin.
- Mikroskop görüntü hücre uzun ekseni belirleyin.
- Hücrenin uzun eksenine dik yönde adımlar hücre taşıyın.
- Optik tuzak uzaklık taşındı ve deplasman kaydedin.
- Önce ölçülen tuzak sertlik kullanılarak uygulanan kuvvet deplasman dönüştürme ve uç deplasman ve kuvvet dosyayı kaydedin.
Başarı Sırları: Adım 8), biri iyi tanımlanmış sıkışmış sonu ile bir hücre bulmak zorundadır. Bazı hücreler sadece bir ucu, diğer ucunda ve bükme kuvveti sıkışmış bir bütün hücre dönme yerine bükme yol açar. Uygun çifti, her hücre joystick kontrollü sahne hareket kullanarak elle hızlı bükerek bulunur.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1: Bu rakam tek bir hücre için kuvvet-deplasman verileri gösterir. Bu çizginin eğimi hücre bükme sertlik.
Discussion
Burada sunulan protokol kantitatif bakteri hücrelerinin bükme özellikleri ölçmek için tasarlanmıştır. Deneme kurulum filamentously büyümeye yapılabilir herhangi bir çubuk şekilli hücre uygulanabilir. Biz başarıyla E. bükülme sertliği sitoskeletal filamentler etkileri prob Bu kurulum coli hücrelerinde. Bu aynı teknikle hücre genel eğilme sertliği belirlenmesinde basıncı, hücre duvarı sertliği ve diğer hücre içi bileşenlerinin rollerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Disclosures
Bu makalenin video prodüksiyon, bu çalışmalarda kullanılan aletler üreten Mad City Labs tarafından sponsor oldu.
Acknowledgments
Mingzhai Sun yüzeylere bağlayıcı hücreleri üzerinde yararlı öneriler kabul etmiş sayılırsınız. Ned Wingreen ve Zemer Gitai değerli tartışmalar için teşekkür ederim. Bu araştırma Ulusal Sağlık hibe P50GM07150 Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödül FİZ-0.844.466 ve Alfred P. Sloan Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895-5G | |
| polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 181978-5G | |
| polylysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 0.5-μm-diameter polystyrene beads | Bangs Laboratories | PS03N | |
| Nano-LP Series nanopositioning system | Mad City Labs | NanoLP series | http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html |
References
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Morris, D. M., Jensen, G. J. Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells. Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).
