تجميد تكسير الديدان الخيطية: طريقة لفضح أنسجة الدودة الداخلية للتلطيخ

Overview

يصف هذا الفيديو تكسير التجميد ، وهي طريقة لجعل أنسجة C. elegans متاحة لتلطيخ الأجسام المضادة عن طريق تعطيل القطع.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من تشانغ وآخرون، وC. elegans Intestine كنموذج ل Lumen Morphogenesis بين الخلايا وفي Biogenesis الغشاء المستقطب في فيفو على مستوى الخلية الواحدة: وضع العلامات بواسطة تلطيخ الأجسام المضادة ، تحليل وتصوير فقدان وظيفة RNAi ، J. Vis. Exp. (2017).

تلطيخ الأجسام المضادة من الأمعاء C. elegans

1. تثبيت
   1. تأخذ شريحة زجاجية نظيفة واستخدام بولي-L-lysine لتوليد فيلم رقيقة للديدان على عصا. ضع 30 ميكرولتر 0.1-0.2٪ بولي-L-lysine على الشريحة ووضع شريحة ثانية على قطرة بولي-L-ليسين لجعل "ساندويتش". ثم فرك الشرائح بلطف عدة مرات لتبلل السطوح بأكملها على حد سواء والسماح لهم الهواء الجاف لمدة 30 دقيقة. تسمية الجانب المتجمد من الشرائح مع قلم رصاص.
      ملاحظة: 0.2٪ بولي-L-ليسين aliquots من 200 μL تم إجراؤها عن طريق حل مسحوق في DH₂O; يمكن تخزين هذا عند -20 درجة مئوية. استخدام الوزن الجزيئي عالية بولي L-ليسين لتحسين الشائكة من الديدان. تركيز البولي-L-ليسين أمر بالغ الأهمية أيضا. تركيزات منخفضة جدا لن تسمح الديدان لعصا ولكن تركيزات عالية جدا قد تولد إشارة خلفية مضان. فيلم سميك جدا قد تخفف في مجملها.
   2. ضع كتلة معدنية مسطحة بقوة على الجزء السفلي من حاوية(على سبيل المثال حاوية البوليسترين) مليئة بالنيتروجين السائل.
      ملاحظة: يمكن للمرء استخدام الثلج الجاف بدلا من ذلك، ولكن النيتروجين السائل يحافظ على كتلة معدنية أكثر استقرارا على قاع الحاوية ويقشعر لها الأبدان بشكل جيد.
   3. جمع الديدان إما عن طريق غسلها من لوحاتها مع M9 أو اختيار الديدان مرحلة مختلفة (إما البيض، L1، L2، L3، أو L4 الديدان المرحلة اليرقات) على كل شريحة. عادة ، اختر ~ 100 يرقة وأجنة أو ~ 20 بالغا لكل شريحة. مكان 10 ميكرولتر غسلها قبالة الديدان على منتصف الشريحة أو اختيار البيض / الديدان في 10 ميكرولتر M9 أو 10 ميكرولتر 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة).
      1. استخدام ماصة لنشر أعداد كبيرة من الديدان لتجنب تكتل.
         ملاحظة: مجموعات مختلطة من الديدان المغسولة ، بسبب الازدحام وسمك مختلف المراحل ، لا تلتصق بشكل جيد وأقل فعالية تجميد متصدع (انظر أدناه) ، وبالتالي فإن اختيار الديدان الخاصة بالمرحلة (أو المجموعات السكانية المتزامنة) يعطي نتائج متفوقة. عصا اليرقات أفضل من البالغين ويمكن وضع المزيد من الحيوانات لكل شريحة.
      2. قبل التقاط الديدان على الشرائح، نقلها إلى لوحة متوسط نمو النيماتودا (NGM) دون البكتيريا OP50. البكتيريا الزائدة الملتصقة بالديدان يمكن أن تتداخل أيضا مع الالتصاق. الحرص على أن الديدان لا تجف.
   4. وضع بلطف (قطرة) 22 ملم × 22 ملم coverslip عبر الطرق على رأس الديدان التي تم جمعها بحيث حوافها معلقة على جانب واحد على الأقل من الشريحة. اضغط على التوالي إلى أسفل بلطف ولكن بحزم مع إصبع واحد أو اثنين على coverslip. تجنب القص الذي من شأنه أن يضر سلامة الأنسجة.
   5. على الفور وبلطف نقل الشريحة إلى كتلة معدنية في النيتروجين السائل والسماح لها الجلوس لمدة 5 دقائق تقريبا لتجميد. ثم "نفض الغبار قبالة" coverslip في خطوة واحدة سريعة باستخدام حافة معلقة.
      ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة بشكل حاسم وبينما يتم تجميد الشريحة لتحقيق "تكسير" من لطيف. تنبيه: يرجى اتباع إرشادات معدات الحماية الشخصية (PPE) عند التعامل مع النيتروجين السائل.
   6. اغمر الشرائح المتشققة بالتجميد في جرة كوبلين زجاجية مملوءة بالميثانوللمدة 5 دقائق عند -20 درجة مئوية. ثم نقل إلى الأسيتونمملوءة الزجاج كوبلين جرة لمدة 5 دقائق أخرى في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تخزين الميثانول والأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بعد التثبيت، يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.
      تنبيه: الميثانول والأسيتون سامان.
   7. إزالة الشرائح من جرة والسماح لهم الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC