선충의 동결 균열 : 염색에 대한 내부 벌레 조직을 노출하는 방법

Overview

이 비디오는 동결 균열, C. elegans 조직을 큐티클을 방해하여 항체 염색에 대한 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 장 외에서발췌, C. elegans 장은 세포 간 루멘 Morphogenesis및 단일 세포 수준에서 생체 이동막 생물 발생에 대한 모델로: 항체 염색에 의한 라벨링, RNAi 기능 분석 및 이미징, J. Vis. Exp. (2017).

C. 예레간 장의 항체 염색

1. 고정
   1. 깨끗한 유리 슬라이드를 가지고 폴리 L-리신을 사용하여 웜이 붙을 수있는 박막을 생성합니다. 슬라이드에 30 μL 0.1-0.2% 폴리 L-리신을 놓고 폴리 L-리신 드롭에 두 번째 슬라이드를 놓아 "샌드위치"를 만듭니다. 그런 다음 슬라이드를 부드럽게 몇 번 문질러 서 둘 다의 전체 표면을 적시고 30 분 동안 공기 건조시키십시오. 슬라이드의 서리가 내린 측면에 연필로 라벨을 지정합니다.
      참고: 0.2% 폴리-L-리신 알리쿼트의 200 μL은 dH₂O로 분말을 용해시킴으로써 만들어졌습니다. 이는 -20°C에서 저장할 수 있습니다. 웜의 고지스틱을 개선하기 위해 고분자량 폴리-L-리신을 사용하십시오. 폴리 L-리신의 농도도 중요합니다. 너무 낮은 농도는 벌레가 붙는 것을 허용하지 않지만 너무 높은 농도는 형광 배경 신호를 생성 할 수 있습니다. 너무 두꺼운 필름은 전체적으로 느슨해질 수 있습니다.
   2. 액체 질소로 채워진용기(예: 폴리스티렌 용기)의 바닥에 평평한 금속 블록을 단단히 놓습니다.
      참고: 하나는 대신 드라이 아이스를 사용할 수 있지만 액체 질소는 용기 바닥에 금속 블록을 더 안정적으로 유지하고 잘 오한다.
   3. M9로 접시를 씻어서 벌레를 수집하거나 각 슬라이드에 다른 단계 벌레 (계란, L1, L2, L3 또는 L4 애벌레 단계 벌레 중 하나)를 선택합니다. 전형적으로, 각 슬라이드에 ~100 개의 애벌레와 배아 또는 ~20 명의 성인을 선택하십시오. 벌레 를 슬라이드 의 중간에 씻어 10 μL을 놓거나 10 μL M9 또는 10 μL 1x PBS (인산염 완충식 식염수)에 계란 / 웜을 선택합니다.
      1. 파이펫을 사용하여 많은 수의 웜을 분산하여 응집하지 않도록 합니다.
         참고: 혼잡과 다양한 단계 두께로 인해 벌레를 씻어낸 혼합 된 인구는 잘 붙어 있지 않으며 덜 효과적으로 동결 금이 가지 않으므로 스테이지 별 웜 (또는 동기화 된 인구)을 선택하면 우수한 결과를 제공합니다. 애벌레 스틱은 성인보다 더 나은 더 많은 동물을 슬라이드 당 배치 할 수 있습니다.
      2. 슬라이드에 벌레를 따기 전에 OP50 박테리아없이 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트로 전송합니다. 벌레를 부착하는 과잉 박테리아는 또한 고집을 방해할 수 있습니다. 벌레가 건조하지 않도록 주의하십시오.
   4. 22mm × 22mm 커버슬립을 수집된 웜 위에 부드럽게 놓아 가장자리가 슬라이드의 한쪽에 걸려 있습니다. 뚜껑에 한두 손가락으로 부드럽게 누르고 단단히 누릅니다. 조직의 무결성을 손상시키는 전단을 피하십시오.
   5. 즉시 부드럽게 액체 질소의 금속 블록에 슬라이드를 전송하고 동결 약 5 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 돌출 된 가장자리를 사용하여 하나의 빠른 이동으로 커버 슬립을 "쓸어".
      참고: 이 단계는 결정적으로 수행해야하며 슬라이드가 동결되어 큐티클의 "균열"을 달성해야합니다. 주의: 액체 질소로 작업할 때 PPE(개인 보호 장비) 지침을 따르십시오.
   6. 동결 금이 간 슬라이드를 메탄올-채워진유리 코플린 항아리에 넣고 -20°C에서 5분 동안 담급됩니다. 그런 다음 -20 °C에서 또 다른 5 분 동안 아세톤채워진 유리 코플린 항아리로 옮김합니다.
      참고: 메탄올과 아세톤은 사용하기 전에 최소 30분 동안 -20°C에 보관해야 한다. 고정 후 슬라이드는 -20 °C에 저장할 수 있습니다.
      주의: 메탄올과 아세톤은 독성이 있습니다.
   7. 항아리에서 슬라이드를 제거하고 사용하기 전에 실온 (RT)에서 공기를 건조하게하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC