הקפאת פיצוח של Nematodes: שיטה לחשוף רקמות תולעת פנים עבור כתמים

Overview

סרטון זה מתאר פיצוח הקפאה, שיטה להנגשת רקמות C. elegans לכתמי נוגדנים על ידי שיבוש הקוטיקל.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך ג'אנג ואח ',המעי C. elegans כמודל לומן Morphogenesis בין תאיים ב Vivo מקוטב קרום Biogenesis ברמת תא יחיד: תיוג על ידי צביעת נוגדנים, RNAi אובדן תפקוד ניתוח הדמיה, J. Vis. Exp. (2017).

כתמי נוגדנים של המעי C. elegans

1. קיבוע
   1. קח שקופית זכוכית נקייה והשתמש בפולי-ל-ליסין כדי ליצור סרט דק שבו תולעים יכולות להידבק. מניחים 30 μL 0.1-0.2% פולי-L-ליסין על השקופית ומניחים שקופית שנייה על טיפת פולי-L-ליסין כדי להפוך "כריך". ואז לשפשף את השקופיות בעדינות כמה פעמים כדי להרטיב את כל המשטחים של שניהם ולתת להם אוויר יבש במשך 30 דקות. סמן את הצד הקפוא של השקופיות בעיפרון.
      הערה: 0.2% aliquots פולי-L-ליצין של 200 μL נעשו על ידי המסת האבקה ב dH₂O; זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (69 °F). השתמש במשקל מולקולרי גבוה פולי-L-ליסטין עבור דבק משופר של התולעים. הריכוז של פולי-L-ליסטין הוא גם קריטי. ריכוזים נמוכים מדי לא יאפשרו לתולעים להידבק, אך ריכוזים גבוהים מדי עלולים ליצור אות רקע פלואורסצנטי. סרט עבה מדי עלול להשתחרר בשלמותו.
   2. מניחים גוש מתכת שטוח בחוזקה על החלק התחתון של מיכל(למשל מיכל פוליסטירן) מלא חנקן נוזלי.
      שים לב: אפשר להשתמש בקרח יבש במקום, אבל חנקן נוזלי שומר על בלוק מתכת יציב יותר בתחתית המיכל ומצמרר היטב.
   3. לאסוף תולעים או על ידי שטיפת אותם את הצלחות שלהם עם M9 או לבחור תולעי שלב שונות (או ביצים, L1, L2, L3, או L4 תולעי שלב הזחל) על כל שקופית. בדרך כלל, בחר ~ 100 זחלים ועוברים או ~ 20 מבוגרים לכל שקופית. מניחים 10 μL שטף את התולעים על אמצע השקופית או לבחור ביצים / תולעים לתוך 10 μL M9 או 10 μL 1x PBS (פוספט אגירה מלוחים).
      1. השתמש פיפטה כדי להפיץ מספר גדול של תולעים כדי למנוע גושים.
         הערה: אוכלוסיות מעורבות של תולעים שנשטפו, עקב צפיפות ועובי שונה של שלבים, אינן נדבקות היטב ופחות סדוקות בהקפאה (ראו להלן), ולכן קטיף תולעים ספציפיות לשלב (או אוכלוסיות מסונכרנות) נותן תוצאות מעולות. זחלים מקל טוב יותר מאשר מבוגרים ובעלי חיים יותר ניתן למקם לכל שקופית.
      2. לפני קטיף תולעים על שקופיות, להעביר אותם לצלחת בינוני צמיחה Nematode (NGM) ללא חיידקי OP50. עודף חיידקים דבקים בתולעים יכול גם להפריע דבק. קחו חלק בכך שתולעים לא יתייבשו.
   4. מניחים בעדינות (טיפה) כיסוי 22 מ"מ × 22 מ"מ על גבי התולעים שנאספו כך הקצוות שלה לתלות מעל לפחות צד אחד של השקופית. לחץ ישר למטה בעדינות אך בחוזקה עם אצבע אחת או שתיים על העטיפה. הימנע גזירה כי יפגע בשלמות הרקמות.
   5. מיד בעדינות להעביר את המגלשה לגוש מתכת חנקן נוזלי ולתת לו לשבת במשך כ 5 דקות להקפיא. לאחר מכן "להעיף" את הכיסוי בצעד אחד מהיר באמצעות הקצה תלוי.
      שים לב: שלב זה חייב להיעשות בנחישות ובעוד השקופית קפואה כדי להשיג "פיצוח" של הקוטיקל. זהירות: יש לפעול בהתאם להנחיות PPE (ציוד הגנה אישי) בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
   6. לטבול את השקופיות סדוקות בהקפאה לתוך צנצנת קופלין זכוכית מלא מתנולבמשך 5 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו לצנצנת קופלין מזכוכית במילוי אצטוןלמשך 5 דקות נוספות ב- -20 מעלות צלזיוס.
      שים לב: מתנול ואצטון צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות לפני השימוש. לאחר הקיבעון, ניתן לאחסן שקופיות ב- -20 °C (69 °F).
      התראה: מתנול ואצטון רעילים.
   7. הסר שקופיות מצנצנת ולתת להם אוויר יבש בטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC