线虫的冷冻裂解：一种暴露内部蠕虫组织进行染色的方法

Overview

此视频描述了冷冻开裂，一种通过破坏皮质层使 C. elegans 组织能够进行抗体染色的方法。

Protocol

本协议摘自张等人，C.elegans肠作为细胞间卢门变形和在Vivo极化膜生物发生在单细胞水平的模型：标签由抗体染色，RNAi功能损失分析和成像，J.Vis.Exp.（2017年）。

C. elegans肠的抗体染色

1. 固定
   1. 采取一个干净的玻璃幻灯片，并使用聚L-lysine产生一个薄膜蠕虫坚持。将 30 μL 0.1-0.2% 聚 L-lysine 放在幻灯片上，并在聚 L-lysine 滴上放置第二张幻灯片，制作"三明治"。然后轻轻擦几次滑梯，弄湿两者的整个表面，让它们干燥30分钟。用铅笔标记幻灯片的磨砂侧。
      注 ：200μL的0.2%聚L-lysine等离子体通过在dH₂O中溶解粉末制成：这可以存储在-20°C。 使用高分子量多L-lysine改善蠕虫的粘附。聚 L-lysine 的浓度也至关重要。浓度过低不会让蠕虫粘住，但过高的浓度可能会产生荧光背景信号。太厚的薄膜可能会整体松动。
   2. 将一个扁平的金属块牢牢地放在装满液氮的容器（如 聚苯乙烯容器）的底部。
      注： 人们可以改用干冰，但液氮使容器底部的金属块更加稳定，并冷却良好。
   3. 收集蠕虫，要么用 M9 从盘子里洗掉它们，要么在每张幻灯片上挑选不同的阶段蠕虫（鸡蛋、L1、L2、L3或L4幼虫）。通常，每次滑梯可采摘约100个幼虫和胚胎或约20个成人。将 10 μL 冲走的蠕虫放在滑梯中间或将鸡蛋/蠕虫放入 10 μL M9 或 10 μL 1x PBS（ 磷酸盐缓冲盐水）中。
      1. 使用移液器传播大量蠕虫，以避免结块。
         注意：由于拥挤和不同阶段的厚度，被冲走的蠕虫的混合种群不能很好地粘附，而且冷冻破裂效果较差（见下文），因此选择特定于阶段的蠕虫（或同步种群）会产生优异的结果。幼虫棒比成人好，每滑梯可以放置更多的动物。
      2. 在将蠕虫采摘到幻灯片上之前，将它们转移到没有OP50细菌的 线虫生长介质（NGM）板 。过量的细菌粘附在蠕虫中也会干扰粘附。小心蠕虫不会干涸。
   4. 轻轻地将 22 毫米× 22 毫米的盖子横向放置在收集的蠕虫顶部，使其边缘至少挂在幻灯片的一侧。用一两根手指轻轻向下轻轻，但用一两根手指在盖上。避免剪切会损害组织完整性。
   5. 立即轻轻地将滑梯转移到液氮中的金属块，让它坐约5分钟冻结。然后使用悬垂边缘快速移动"甩掉"盖片。
      注： 这一步骤必须果断地完成，同时冻结滑梯以实现地层的"开裂"。注意：使用液氮时，请遵循 PPE（个人防护设备）指南。
   6. 在 -20 °C 时将冷冻裂开的滑梯浸入甲 醇填充玻璃科普林罐中 5 分钟。 然后转移到 丙酮填充玻璃科普林罐在 -20 °C 下再 5 分钟。
      注： 甲醇和丙酮应储存在-20°C至少30分钟使用前。固定后，幻灯片可存储在 -20 °C。
      注意： 甲醇和乙酮是有毒的。
   7. 从罐中取出滑梯，让它们在使用前在室温 （RT） 下干燥。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC