Freeze-Cracking af Nematoder: En metode til at udsætte interiør orm væv til farvning

Overview

Denne video beskriver fryse-revner, en metode til at gøre C. elegans væv tilgængelige for antistof farvning ved at forstyrre neglebånd.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis og In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Antistof farvning af C. elegans tarmen

1. Fiksering
   1. Tag en ren glasrutsjebane og brug poly-L-lysin til at generere en tynd film, som orme kan holde fast i. Placer 30 μL 0,1-0,2% poly-L-lysin på diaset og læg et andet dias på poly-L-lysin dråben for at lave en "sandwich". Gnid derefter rutsjebanerne forsigtigt et par gange for at våd hele overfladerne på begge og lad dem lufttørre i 30 minutter. Mærk den matterede side af diasene med blyant.
      BEMÆRK: 0,2% poly-L-lysin aliquots på 200 μL blev fremstillet ved opløsning af pulveret i dH₂O; dette kan opbevares ved -20 °C. Brug høj molekylvægt poly-L-lysin for forbedret stikning af orme. Koncentrationen af poly-L-lysin er også kritisk. For lave koncentrationer vil ikke tillade orme at holde, men for høje koncentrationer kan generere fluorescens baggrundssignal. En for tyk film kan løsne op i sin helhed.
   2. Placer en flad metalblok fast på bunden af en beholder (f.eks. en polystyrenbeholder) fyldt med flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Man kan bruge tøris i stedet, men flydende nitrogen holder en metalblok mere stabil på beholderbunden og kuldegysninger godt.
   3. Saml orme enten ved at vaske dem af deres plader med M9 eller vælge forskellige scene orme (enten æg, L1, L2, L3, eller L4 larve fase orme) på hvert dias. Vælg typisk ~ 100 larver og embryoner eller ~ 20 voksne til hvert dias. Placer 10 μL udvaskede orme på midten af diaset, eller pluk æg/orme i 10 μL M9 eller 10 μL 1x PBS (fosfat bufferet saltvand).
      1. Brug en pipette til at sprede et stort antal orme for at undgå klumpning.
         Bemærk: Blandede populationer af udvaskede orme, på grund af trængsel og forskellige tykkelser af faser, ikke holde godt og er mindre effektivt fryse-krakket (se nedenfor), derfor picking fase-specifikke orme (eller synkroniseret populationer) giver overlegne resultater. Larver holder bedre end voksne, og flere dyr kan placeres pr. Dias.
      2. Før du plukker orme på dias, skal du overføre dem til en Nematode Growth Medium (NGM) plade uden OP50 bakterier. Overskydende bakterier klæber til orme kan også forstyrre stikning. Pas på, at orme ikke tørrer ud.
   4. Placer forsigtigt (drop) en 22 mm × 22 mm coverslip cross-ways oven på de indsamlede orme, således at dens kanter hænger over på mindst den ene side af diaset. Tryk lige ned forsigtigt, men fast med en eller to fingre på coverlip. Undgå klipning, der vil skade vævsintegriteten.
   5. Overfør straks og forsigtigt rutsjebanen til metalblokken i flydende nitrogen og lad den sidde i ca. 5 minutter for at fryse. Derefter "svirp off" coverlip i en hurtig bevægelse ved hjælp af overhængende kant.
      BEMÆRK: Dette trin skal gøres beslutsomt, og mens diaset er frosset for at opnå "revner" af neglebåndet. Forsigtig: Følg retningslinjerne for personlige værnemidler, når du arbejder med flydende nitrogen.
   6. De frysekrakkede rutsjebaner nedsænkes i en coplinglasglasglas fyldt med methanoli 5 minutter ved -20 °C. Derefter overføres til en acetone-fyldtglas Coplin krukke i yderligere 5 minutter ved -20 °C.
      BEMÆRK: Methanol og acetone skal opbevares i -20 °C i mindst 30 minutter før brug. Efter fiksering kan dias opbevares ved -20 °C.
      ADVARSEL: methanol og acetone er giftige.
   7. Fjern rutsjebaner fra krukken og lad dem lufttørre ved stuetemperatur (RT) før brug.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC