Freeze-Cracking van nematoden: een methode om inwendige wormweefsels bloot te leggen voor vlekken

Overview

Deze video beschrijft freeze-cracking, een methode om C. elegans weefsels toegankelijk te maken voor antilichaamkleuring door de nagelriem te verstoren.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Antilichaamkleuring van de C. elegans darm

1. Fixatie
   1. Neem een schone glazen glijbaan en gebruik poly-L-lysine om een dunne film te genereren waar wormen op kunnen plakken. Plaats 30 μL 0,1-0,2% poly-L-lysine op de glijbaan en plaats een tweede glijbaan op de poly-L-lysine druppel om een "sandwich" te maken. Wrijf vervolgens de dia's een paar keer zachtjes in om de hele oppervlakken van beide nat te maken en laat ze 30 minuten aan de lucht drogen. Label de berijpte kant van de dia's met potlood.
      OPMERKING: 0,2% poly-L-lysine aliquots van 200 μL werden gemaakt door het poeder op te lossen in dH₂O; dit kan worden opgeslagen bij -20 °C. Gebruik poly-L-lysine met een hoog molecuulgewicht voor een betere hechting van de wormen. De concentratie van poly-L-lysine is ook kritiek. Te lage concentraties laten wormen niet plakken, maar te hoge concentraties kunnen een fluorescentieachtergrondsignaal genereren. Een te dikke film kan in zijn geheel loskomen.
   2. Plaats een plat metalen blok stevig op de bodem van een container(bijv. een polystyreencontainer) gevuld met vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Men kan in plaats daarvan droogijs gebruiken, maar vloeibare stikstof houdt een metalen blok stabieler op de bodem van de container en koelt goed.
   3. Verzamel wormen door ze van hun borden af te wassen met M9 of pluk verschillende stadiumwormen (eieren, L1, L2, L3 of L4 larvale stadiumwormen) op elke dia. Pluk meestal ~ 100 larven en embryo's of ~ 20 volwassenen op elke dia. Plaats 10 μL afgewassen wormen op het midden van de glijbaan of pluk eieren/wormen in 10 μL M9 of 10 μL 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
      1. Gebruik een pipet om grote aantallen wormen uit te spreiden om klonteren te voorkomen.
         Opmerking: Gemengde populaties van afgewassen wormen, als gevolg van verdringing en verschillende dikte van stadia, blijven niet goed plakken en zijn minder effectief gevriesdroogd (zie hieronder), daarom geeft het plukken van stadiumspecifieke wormen (of gesynchroniseerde populaties) superieure resultaten. Larven plakken beter dan volwassenen en er kunnen meer dieren per dia worden geplaatst.
      2. Voordat u wormen op dia's plukt, moet u ze overbrengen naar een Nematode Growth Medium (NGM)-plaat zonder OP50-bacteriën. Overtollige bacteriën die zich aan de wormen hechten, kunnen ook het plakken verstoren. Zorg ervoor dat wormen niet uitdrogen.
   4. Plaats (laat) voorzichtig een 22 mm × 22 mm coverslip cross-ways over de verzamelde wormen, zodat de randen aan ten minste één kant van de glijbaan hangen. Druk voorzichtig maar stevig met één of twee vingers op de afdeklip recht naar beneden. Vermijd scheren dat de weefselintegriteit zal beschadigen.
   5. Breng de schuif onmiddellijk en voorzichtig over op het metalen blok in vloeibare stikstof en laat het ongeveer 5 minuten zitten om in te vriezen. "Veeg vervolgens de coverslip in één snelle beweging af met behulp van de overhangende rand.
      OPMERKING: Deze stap moet resoluut worden uitgevoerd en terwijl de dia wordt bevroren om "barsten" van de nagelriem te bereiken. Let op: Volg de PBM-richtlijnen (Personal Protection Equipment) bij het werken met vloeibare stikstof.
   6. Dompel de gevriesdroogde dia's gedurende 5 minuten bij -20 °C onder in een methanolgevulde glazen coplinpot. Breng vervolgens nog 5 minuten bij -20 °C over in een met acetongevulde glazen Coplin-pot.
      OPMERKING: Methanol en aceton moeten vóór gebruik ten minste 30 minuten in -20 °C worden bewaard. Na fixatie kunnen dia's worden opgeslagen bij -20 °C.
      LET OP: methanol en aceton zijn giftig.
   7. Verwijder de dia's uit de pot en laat ze voor gebruik aan de lucht drogen op kamertemperatuur (RT).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC