Freeze-Cracking of Nematodes: A Method to Expose Interior Worm Tissues for Staining

Overview

Cette vidéo décrit le gel-fissuration, une méthode pour rendre les tissus C. elegans accessibles pour la coloration des anticorps en perturbant la cuticule.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Zhang et coll.,The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Coloration d’anticorps de l’intestin de C. elegans

1. fixation
   1. Prenez une lame de verre propre et utilisez la poly-L-lysine pour générer un film mince pour que les vers collent. Placez 30 μL 0,1 à 0,2 % de poly-L-lysine sur la lame et placez une deuxième diapositive sur la goutte de poly-L-lysine pour faire un « sandwich ». Frottez ensuite doucement les glissières à quelques reprises pour mouiller toutes les surfaces des deux et les laisser sécher à l’air pendant 30 min. Étiquetez le côté givré des glissières au crayon.
      REMARQUE : 0,2 % d’aliquots poly-L-lysine de 200 μL ont été fabriqués en dissolvant la poudre en dH₂O; cela peut être stocké à -20 °C. Utilisez la poly-L-lysine à poids moléculaire élevé pour améliorer le collage des vers. La concentration de poly-L-lysine est également critique. Des concentrations trop faibles ne permettront pas aux vers de coller, mais des concentrations trop élevées peuvent générer un signal de fond de fluorescence. Un film trop épais peut se détendre dans son intégralité.
   2. Placez fermement un bloc métallique plat sur le fond d’un récipient(p. ex. un contenant en polystyrène) rempli d’azote liquide.
      REMARQUE: On peut utiliser de la glace sèche à la place, mais l’azote liquide maintient un bloc métallique plus stable sur le fond du récipient et se refroidit bien.
   3. Recueillir les vers soit en les lavant de leurs assiettes avec M9 ou choisir différents vers de scène (soit les oeufs, L1, L2, L3, ou L4 vers de stade larvaire) sur chaque diapositive. En règle générale, choisissez ~100 larves et embryons ou ~20 adultes à chaque diapositive. Placez 10 μL lavés sur les vers au milieu de la lame ou cueillez les œufs/vers en 10 μL M9 ou 10 μL 1x PBS (saline tamponnée au phosphate).
      1. Utilisez une pipette pour étaler un grand nombre de vers pour éviter de s’agglutiner.
         Remarque : Les populations mixtes de vers lavés, en raison de l’encombrement et de l’épaisseur différente des stades, ne collent pas bien et sont moins efficacement fissurées par le gel (voir ci-dessous), ce qui donne des résultats supérieurs à la cueillette de vers spécifiques au stade (ou de populations synchronisées). Les larves collent mieux que les adultes et plus d’animaux peuvent être placés par toboggan.
      2. Avant de ramasser les vers sur des toboggans, transférez-les dans une plaque de nematode Growth Medium (NGM) sans bactéries OP50. L’excès de bactéries adhérentes aux vers peut également interférer avec le collage. Faites attention que les vers ne se dessèchent pas.
   4. Placez délicatement (déposez) une barre transversale de 22 mm × 22 mm sur les vers recueillis de sorte que ses bords pendent sur au moins un côté de la glissière. Appuyez tout droit vers le bas doucement mais fermement avec un ou deux doigts sur le coverslip. Évitez le cisaillement qui endommagera l’intégrité des tissus.
   5. Transférer immédiatement et délicatement la lame sur le bloc métallique dans de l’azote liquide et laisser reposer environ 5 minutes pour congeler. Puis « flick off » le coverslip en un seul mouvement rapide en utilisant le bord en surplomb.
      REMARQUE: Cette étape doit être effectuée de manière décisive et pendant que la lame est gelée pour atteindre la « fissuration » de la cuticule. Attention : Veuillez suivre les lignes directrices de l’EPI (Personal Protection Equipment) lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.
   6. Plongez les glissières fissurées au gel dans un bocalcoplin en verre rempli de méthanol pendant 5 min à -20 °C. Ensuite, transférer dans un bocalcoplin en verre rempli d’acétone pendant encore 5 min à -20 °C.
      REMARQUE: Le méthanol et l’acétone doivent être conservés en -20 °C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Après fixation, les glissières peuvent être stockées à -20 °C.
      ATTENTION : le méthanol et l’acétone sont toxiques.
   7. Retirer les glissières du bocal et les laisser sécher à l’air libre à température ambiante (RT) avant utilisation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC