फ्रीज-नेमाटोड के खुर: एक विधि धुंधला के लिए आंतरिक कृमि ऊतकों का पर्दाफाश करने के लिए

Overview

इस वीडियो फ्रीज खुर, एक विधि सी elegans ऊतकों को क्यूटिकल में खलल न डालें द्वारा एंटीबॉडी धुंधला के लिए सुलभ बनाने का वर्णन करता है ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल झांग एट अल, सी एलिगेंस आंत से इंटरसेलुलर लुमेन मॉर्फोजेनेसिस के लिए एक मॉडल के रूप में और एकल सेल स्तर पर वीवो पोलर्ड झिल्ली बायोजेनेसिस में एक अंश है: एंटीबॉडी स्टेनिंग द्वारा लेबलिंग, आरएनएआई लॉस-ऑफ-फंक्शन एनालिसिस एंड इमेजिंग, जे विस एक्सप्रेस (2017)।

सी एलिगेंस आंत का एंटीबॉडी धुंधला

1. निर्धारण
   1. एक साफ ग्लास स्लाइड लें और कीड़े के लिए एक पतली फिल्म उत्पन्न करने के लिए पॉली-एल-लिसाइन का उपयोग करें। स्लाइड पर 30 μL 0.1-0.2% पॉली-एल-lysine रखें और एक "सैंडविच" बनाने के लिए पॉली-एल-lysine ड्रॉप पर एक दूसरी स्लाइड रखें। फिर स्लाइड्स को धीरे-धीरे कई बार रगड़ें ताकि दोनों की पूरी सतहों को गीला किया जा सके और उन्हें 30 मिनट तक हवा सूखने दें । पेंसिल के साथ स्लाइड के पाले से ओढ़ लिया पक्ष लेबल।
      नोट: 0.2% पॉली-एल-lysine aliquots 200 μL के dH₂O में पाउडर भंग करके किए गए थे; इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। कीड़े के बेहतर चिपके रहने के लिए उच्च आणविक वजन पॉली-एल-लिसिन का उपयोग करें। पॉली-एल-लिसिन की एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है। बहुत कम सांद्रता कीड़े को चिपकने की अनुमति नहीं देगी लेकिन बहुत अधिक सांद्रता फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न कर सकती है। एक बहुत मोटी फिल्म अपनी संपूर्णता में ढीला हो सकता है ।
   2. तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर(जैसे पॉलीस्टीरिन कंटेनर) के तल पर एक सपाट धातु ब्लॉक मजबूती से रखें।
      नोट: एक के बजाय सूखी बर्फ का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन तरल नाइट्रोजन एक धातु ब्लॉक कंटेनर नीचे पर अधिक स्थिर रहता है और अच्छी तरह से ठंड लगना ।
   3. कीड़े को या तो M9 के साथ अपनी प्लेटों से धोकर या प्रत्येक स्लाइड पर विभिन्न चरण कीड़े (या तो अंडे, एल 1, एल 2, एल 3, या एल 4 लार्वा चरण कीड़े) उठाकर ले लीजिए। आमतौर पर, प्रत्येक स्लाइड में ~ 100 लार्वा और भ्रूण या ~ 20 वयस्कों को चुनें। स्लाइड के बीच पर 10 μL धोया कीड़े रखें या 10 μL M9 या 10 μL 1x PBS (फॉस्फेट बफर खारा) में अंडे/कीड़े उठाओ ।
      1. झुरमुट से बचने के लिए बड़ी संख्या में कीड़े फैलाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
         नोट: भीड़ और चरणों की विभिन्न मोटाई के कारण धोया कीड़े की मिश्रित आबादी, अच्छी तरह से छड़ी नहीं है और कम प्रभावी ढंग से फ्रीज-फटा (नीचे देखें), इसलिए चरण-विशिष्ट कीड़े (या सिंक्रोनाइज्ड आबादी) उठा बेहतर परिणाम देता है । लार्वा वयस्कों की तुलना में बेहतर छड़ी और अधिक जानवरों को प्रति स्लाइड रखा जा सकता है।
      2. स्लाइड पर कीड़े चुनने से पहले, उन्हें OP50 बैक्टीरिया के बिना एक सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेट में स्थानांतरित करें। कीड़े के अनुयायी अतिरिक्त बैक्टीरिया भी चिपके रहने में हस्तक्षेप कर सकते हैं। ध्यान रखें कि कीड़े सूख न जाएं।
   4. धीरे-धीरे 22 मिमी × 22 मिमी कवरलिप क्रॉस-वे एकत्र किए गए कीड़े के शीर्ष पर इस तरह से रखें कि इसके किनारे स्लाइड के कम से कम एक तरफ लटक जाएं। सीधे धीरे से नीचे दबाएं लेकिन कवरस्लिप पर एक या दो उंगलियों के साथ मजबूती से। कतरनी से बचें जो ऊतक अखंडता को नुकसान पहुंचाएगा।
   5. तुरंत और धीरे से तरल नाइट्रोजन में धातु ब्लॉक करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण और यह फ्रीज करने के लिए के बारे में 5 मिनट के लिए बैठते हैं । फिर ओवरहैंगिंग एज का उपयोग करके एक स्विफ्ट चाल में कवरस्लिप को "झटका" दें।
      नोट: यह कदम निर्णायक रूप से किया जाना चाहिए और जबकि स्लाइड क्यूटिकल के "क्रैकिंग" को प्राप्त करने के लिए जमे हुए हैं। सावधानी: तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय पीपीई (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण) दिशानिर्देशों का पालन करें।
   6. फ्रीज-फटा स्लाइड को -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मेथनॉलसे भरे ग्लास कॉपलिन जार में विसर्जित करें। फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए एक एसीटोनसे भरे ग्लास कॉपलिन जार में स्थानांतरित करें।
      नोट: उपयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए मेथनॉल और एसीटोन को -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जाना चाहिए। फिक्सेशन के बाद, स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      सावधानी: मेथनॉल और एसीटोन जहरीले होते हैं।
   7. जार से स्लाइड निकालें और उपयोग से पहले उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर हवा सूखने दें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC