Congelamento-cracking dei nematodi: un metodo per esporre i tessuti dei vermi interni per la colorazione

Overview

Questo video descrive il congelamento-cracking, un metodo per rendere i tessuti C. elegans accessibili per la colorazione degli anticorpi interrompendo la cuticola.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp.

Colorazione anticorpale dell'intestino C. elegans

1. fissazione
   1. Prendi uno scivolo di vetro pulito e usa la poli-L-lisina per generare una pellicola sottile su cui i vermi si attaccano. Posizionare 30 μL 0,1-0,2% di poli-L-lisina sullo scivolo e posizionare una seconda diapositiva sulla goccia di poli-L-lisina per fare un "panino". Quindi strofinare delicatamente gli scivoli alcune volte per bagnare tutte le superfici di entrambi e lasciarli asciugare all'aria per 30 minuti. Etichettare il lato smerigliato delle diapositive con la matita.
      NOTA: Le aliquote di poli-L-lisina dello 0,2% di 200 μL sono state effettuate sciogliendo la polvere in dH₂O; questo può essere conservato a -20 °C. Utilizzare poli-L-lisina ad alto peso molecolare per migliorare l'incollaggio dei vermi. Anche la concentrazione di poli-L-lisina è critica. Concentrazioni troppo basse non permetteranno ai vermi di attaccarsi, ma concentrazioni troppo elevate possono generare segnale di fondo a fluorescenza. Un film troppo spesso può allentarsi nella sua interezza.
   2. Posizionare saldamente un blocco metallico piatto sul fondo di uncontenitore (ad esempio un contenitore di polistirolo) riempito con azoto liquido.
      NOTA: Si può invece usare ghiaccio secco, ma l'azoto liquido mantiene un blocco metallico più stabile sul fondo del contenitore e si raffrecca bene.
   3. Raccogli i vermi lavandoli dai loro piatti con M9 o raccogli diversi vermi dello stadio (uova, L1, L2, L3 o vermi dello stadio larvale L4) su ogni diapositiva. In genere, scegli ~ 100 larve ed embrioni o ~ 20 adulti per ogni diapositiva. Posizionare 10 μL lavati via dai vermi al centro dello scivolo o raccogliere uova/vermi in 10 μL M9 o 10 μL 1x PBS (salina tamponata con fosfato).
      1. Utilizzare una pipetta per distribuire un gran numero di vermi per evitare di grumi.
         Nota: le popolazioni miste di vermi lavati via, a causa dell'affollamento e del diverso spessore degli stadi, non si attaccano bene e sono meno efficacemente congelate (vedi sotto), quindi la raccolta di vermi specifici dello stadio (o popolazioni sincronizzate) dà risultati superiori. Le larve si attaccano meglio degli adulti e più animali possono essere posizionati per diapositiva.
      2. Prima di raccogliere vermi su diapositive, trasferirli su una piastra Nematode Growth Medium (NGM) senza batteri OP50. I batteri in eccesso aderenti ai vermi possono anche interferire con l'incollaggio. Fai attenzione che i vermi non si asciughino.
   4. Posizionare delicatamente (far cadere) un cross-cross-ways di 22 mm × 22 mm di coverslip sopra i vermi raccolti in modo che i suoi bordi pendeno su almeno un lato dello scivolo. Premere dritto verso il basso delicatamente ma saldamente con una o due dita sul coperchio. Evitare la tosatura che danneggerà l'integrità dei tessuti.
   5. Trasferire immediatamente e delicatamente lo scivolo nel blocco metallico in azoto liquido e lasciarlo riposare per circa 5 minuti per congelare. Quindi "sfarfalla" il coverslip in una mossa rapida usando il bordo strapiombante.
      NOTA: Questo passaggio deve essere fatto in modo decisivo e mentre lo scivolo è congelato per ottenere "fessurazione" della cuticola. Attenzione: si prega di seguire le linee guida DPI (Personal Protection Equipment) quando si lavora con azoto liquido.
   6. Immergere gli scivoli congelati in un barattolo dicoplin di vetro riempito di metanolo per 5 minuti a -20 °C. Quindi trasferire in un barattolo dicoplin di vetro riempito di acetone per altri 5 minuti a -20 °C.
      NOTA: Il metanolo e l'acetone devono essere conservati in -20 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso. Dopo la fissazione, le diapositive possono essere conservate a -20 °C.
      ATTENZIONE: metanolo e acetone sono tossici.
   7. Rimuovere i vetrini dal barattolo e lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC