線虫の凍結割れ:染色のための内性虫組織を暴露する方法

Overview

このビデオでは 、C.エレガンス 組織をキューティクルを破壊して抗体染色にアクセスできるようにする方法であるフリーズクラッキングについて説明します。

Protocol

このプロトコルは、単細胞レベルにおける細胞間内腔形態形成および生体内偏光膜生物形成のモデルとしてのC.エレガンス腸からの抜粋である:抗体染色による標識、RNAi機能喪失分析およびイメージング、J.Vis. Exp. (2017)。

C.エレガンス腸の抗体染色

1. 固定
   1. きれいなガラススライドを取り、ポリL-リジンを使用して、ワームが付着するための薄膜を生成します。スライド上に30 μL 0.1-0.2% ポリL-リジン を配置し、ポリL-リジンドロップに2番目のスライドを置いて「サンドイッチ」を作ります。その後、スライドを数回やさしくこすって両方の表面全体を濡らし、30分間空気乾燥させます。スライドの曇った側に鉛筆でラベルを付けます。
      注:200 μLの0.2%ポリL-リジンアリコートは、粉末を_dH2Oに溶解して作られました。これは-20°Cで貯えることができる。 ワームの固着性を向上させるには、高分子量ポリL-リジンを使用してください。ポリL-リジンの濃度も重要です。.濃度が低すぎるとワームは付着しませんが、濃度が高すぎると蛍光バックグラウンドシグナルが生成される可能性があります。厚すぎるフィルムは、その全体を緩める可能性があります。
   2. 液体窒素を充填した容器の底部(例えば ポリスチレン容器)にしっかりと平らな金属ブロックを置きます。
      注: 代わりにドライアイスを使用することができますが、液体窒素は容器底の金属ブロックをより安定に保ち、よく冷やします。
   3. M9でプレートを洗い流してワームを収集するか、各スライドに異なるステージワーム(卵、L1、L2、L3、またはL4幼虫ステージワームのいずれか)を選びます。通常、各スライドに〜100の幼虫と胚または〜20人の成人を選ぶ。10 μL をスライドの中央に流し込むか、卵/虫を 10 μL M9 または 10 μL 1x PBS (リン酸緩衝生理食塩水) に取り込みます。
      1. ピペットを使用して多数のワームを拡散させ、凝集を避けてください。
         注: 洗浄されたワームの混合集団は、混雑と異なる段階の厚さのために、うまく固執せず、効果的に凍結割れ(下記参照)されるため、ステージ固有のワーム(または同期された集団)を選ぶことは優れた結果を与えます。幼虫は大人よりも優れたスティックと、より多くの動物は、スライドごとに配置することができます。
      2. 虫をスライドに摘み取る前に、OP50細菌を含まない 線虫成長培地(NGM)プレート に移します。ワームに付着した過剰な細菌も付着を妨げる可能性があります。虫が乾かないように注意してください。
   4. 収集したワームの上に22mm×22mmのカバースリップを交差させて、そのエッジがスライドの少なくとも片側に掛かるような場所にゆっくりと置きます。カバースリップに1本または2本の指を置いて、まっすぐ下に押し下げます。組織の完全性を損なうせん断は避けてください。
   5. すぐに静かに液体窒素の金属ブロックにスライドを移し、約5分間座らせて凍結させます。その後、張り出したエッジを使用して、1つの迅速な動きでカバースリップを「フリックオフ」します。
      注: このステップは、キューティクルの「割れ」を達成するためにスライドが凍結されている間、決定的に行われなければなりません。注意: 液体窒素を使用する場合は、PPE(個人保護具)ガイドラインに従ってください。
   6. 凍結割れたスライドを メタノール充填ガラスコプリン瓶に-20°Cで5分間浸します。 その後、 アセトン充填ガラスコプリン瓶に-20°Cでさらに5分間移します。
      注: メタノールとアセトンは、使用前に少なくとも30分間-20°Cで保存する必要があります。固定後、スライドは-20°Cで保存することができます。
      注意: メタノールとアセトンは有毒です。
   7. 瓶からスライドを取り出し、使用前に室温(RT)で空気乾燥させます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC