Freeze-Cracking av Nematoder: En metode for å eksponere innvendig ormvev for farging

Overview

Denne videoen beskriver fryse-cracking, en metode for å gjøre C. elegans vev tilgjengelig for antistofffarging ved å forstyrre kutiklet.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Antistofffarging av C. elegans tarmen

1. Fiksering
   1. Ta en ren glasssklie og bruk poly-L-lysin for å generere en tynn film for ormer å holde fast på. Plasser 30 μL 0,1-0,2% poly-L-lysin på lysbildet og legg et nytt lysbilde på poly-L-lysindråpen for å lage et "smørbrød". Gni deretter lysbildene forsiktig noen ganger for å våte hele overflatene av begge og la dem lufttørke i 30 minutter. Merk den frostede siden av lysbildene med blyant.
      MERK: 0,2% poly-L-lysin aliquots på 200 μL ble laget ved å oppløse pulveret i dH₂O; Dette kan oppbevares ved -20 °C. Bruk høy molekylvekt poly-L-lysin for forbedret klebende ormer. Konsentrasjonen av poly-L-lysin er også kritisk. For lave konsentrasjoner vil ikke tillate ormer å holde seg fast, men for høye konsentrasjoner kan generere fluorescens bakgrunnssignal. En for tykk film kan løsne opp i sin helhet.
   2. Plasser en flat metallblokk fast på bunnen av en beholder (f.eks. en polystyrenbeholder) fylt med flytende nitrogen.
      MERK: Man kan bruke tørris i stedet, men flytende nitrogen holder en metallblokk mer stabil på beholderbunnen og kjøler godt.
   3. Samle ormer enten ved å vaske dem av platene sine med M9 eller velg forskjellige sceneormer (enten egg, L1, L2, L3 eller L4 larval stage ormer) på hvert lysbilde. Velg vanligvis ~ 100 larver og embryoer eller ~ 20 voksne til hvert lysbilde. Plasser 10 μL vasket av ormer på midten av lysbildet eller plukk egg / ormer i 10 μL M9 eller 10 μL 1x PBS (fosfatbufret saltvann).
      1. Bruk en pipette til å spre ut et stort antall ormer for å unngå klumping.
         Merk: Blandede populasjoner av vasket av ormer, på grunn av trengsel og forskjellig tykkelse på stadier, holder seg ikke godt og er mindre effektivt fryse-sprukket (se nedenfor), derfor plukke scenespesifikke ormer (eller synkroniserte populasjoner) gir overlegne resultater. Larver holder seg bedre enn voksne, og flere dyr kan plasseres per lysbilde.
      2. Før du plukker ormer på lysbilder, må du overføre dem til en NGM-plate (Nematode Growth Medium) uten OP50-bakterier. Overflødige bakterier som følges av ormene, kan også forstyrre stikkende. Pass på at ormer ikke tørker ut.
   4. Plasser forsiktig (slipp) en 22 mm × 22 mm deksler på tvers av de oppsamlede ormene slik at kantene henger over på minst den ene siden av lysbildet. Trykk rett ned forsiktig, men fast med en eller to fingre på dekslene. Unngå skjæring som vil skade vevsintegriteten.
   5. Overfør straks og forsiktig gliden til metallblokken i flytende nitrogen og la den sitte i ca. 5 minutter for å fryse. Deretter "flikker av" dekslene i ett raskt trekk ved hjelp av den overliggende kanten.
      MERK: Dette trinnet må gjøres avgjørende, og mens lysbildet er frosset for å oppnå "sprekker" av kutiklet. Advarsel: Følg retningslinjene for personlig verneutstyr når du arbeider med flytende nitrogen.
   6. Senk de frysesprekkede skliene ned i en metanolfyltCoplin-krukke i 5 minutter ved -20 °C. Overfør deretter til en acetonfyltCoplin krukke i 5 min ved -20 °C.
      MERK: Metanol og aceton skal oppbevares i -20 °C i minst 30 minutter før bruk. Etter fiksering kan lysbilder lagres ved -20 °C.
      FORSIKTIG: metanol og aceton er giftige.
   7. Fjern sklier fra krukken og la dem lufttørke ved romtemperatur (RT) før bruk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC