Замораживание-cracking нематод: Метод подвергать внутренних червей ткани для окрашивания

Overview

Это видео описывает замораживание растрескивания, метод, чтобы сделать ткани C. elegans доступными для окрашивания антител, нарушая кутикулу.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Чжан и др., C. elegans кишечника в качестве модели для межклеточного люмена Morphogenesis и In Vivo поляризованной мембраны биогенез на одноклеточном уровне: Маркировка антитела окрашивания, РНК Потери функции анализа и визуализации, J. Vis. Exp. (2017).

Антитела окрашивания кишечника C. elegans

1. фиксация
   1. Возьмите чистый стеклянный слайд и использовать поли-L-лизин для создания тонкой пленки для червей придерживаться. Поместите 30 йл 0,1-0,2% поли-L-лизин на слайде и поместите второй слайд на поли-L-лизин капли, чтобы сделать "сэндвич". Затем протрите слайды осторожно несколько раз, чтобы промокнуть все поверхности обоих и дайте им высохнуть в течение 30 минут. Наклеить карандашом матовую сторону слайдов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,2% поли-L-лизина aliquots 200 йл были сделаны путем растворения порошка в dH₂O; это может храниться при -20 градусов по Цельсию. Используйте высокий молекулярный вес поли-L-лизина для улучшения прилипания червей. Концентрация поли-L-лизина также имеет решающее значение. Слишком низкие концентрации не позволят червям придерживаться, но слишком высокие концентрации могут генерировать фоновый сигнал флуоресценции. Слишком толстая пленка может ослабить в полном объеме.
   2. Поместите плоский металлический блок твердо на дно контейнера(например, полистирола контейнер), наполненный жидким азотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого можно использовать сухой лед, но жидкий азот сохраняет металлический блок более стабильным на дне контейнера и хорошо охлаждается.
   3. Соберите червей либо мыть их с их пластин с M9 или выбрать различные черви этапе (либо яйца, L1, L2, L3, или L4 личинки этапе червей) на каждом слайде. Как правило, выберите 100 личинок и эмбрионов или 20 взрослых на каждый слайд. Поместите 10 йл смываются червей на середину слайда или забрать яйца / червей в 10 йл M9 или 10 йл 1x PBS (фосфат буфера солевого раствора).
      1. Используйте пипетки, чтобы распространить большое количество червей, чтобы избежать слипания.
         Примечание: Смешанные популяции смытых червей, из-за скученсти и различной толщины этапов, не прилипают хорошо и менее эффективно замораживаются (см. ниже), поэтому сбор специфических этапов червей (или синхронизированных популяций) дает превосходные результаты. Larvae придерживаться лучше, чем взрослые и больше животных могут быть помещены на слайд.
      2. Прежде чем собирать червей на слайды, перенесите их на пластину Nematode Growth Medium (NGM) без бактерий OP50. Избыток бактерий, придерживаясь червей также может помешать прилипания. Позаботьтесь о том, чтобы черви не высохли.
   4. Аккуратно поместите (падение) 22 мм × 22 мм крышки поперечных путей на вершине собранных червей так, что его края висят по крайней мере на одной стороне слайда. Нажмите прямо вниз мягко, но твердо с одним или двумя пальцами на крышке. Избегайте стрижки, которая повредит целостность тканей.
   5. Немедленно и аккуратно перенесите слайд в металлический блок в жидком азоте и дайте ему посидеть около 5 минут, чтобы заморозить. Затем "отмять" крышку в один быстрый шаг с помощью нависающей края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть сделан решительно и в то время как слайд заморожен для достижения "трещины" кутикулы. Внимание: Пожалуйста, следуйте рекомендациям PPE (Personal Protection Equipment) при работе с жидким азотом.
   6. Погрузите замерзаемые горки в заполненную метаноломстеклянную банку Coplin в течение 5 минут при -20 градусах Цельсия. Затем перенесите в заполненныйацетоном стеклянный банку Coplin еще на 5 минут при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол и ацетон должны храниться в -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 минут перед использованием. После фиксации слайды могут храниться при -20 градусов по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: метанол и ацетон токсичны.
   7. Удалите слайды из банки и дайте им высохнуть при комнатной температуре (RT) перед использованием.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC