Freeze-Cracking von Nematoden: Eine Methode zur Belichtung von inneren Wurmgeweben für die Färbung

Overview

Dieses Video beschreibt Freeze-Cracking, eine Methode, um C. elegans Gewebe für Die Antikörperfärbung zugänglich zu machen, indem die Nagelhaut gestört wird.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-Cell Level: Labeling by Antikörper Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).

Antikörperfärbung des C. elegans Darms

1. Fixierung
   1. Nehmen Sie eine saubere Glasfolie und verwenden Sie Poly-L-Lysin, um einen dünnen Film für Würmer zu erzeugen, auf die sie kleben können. Legen Sie 30 l 0,1-0,2% Poly-L-Lysin auf das Dia und legen Sie ein zweites Dia auf den Poly-L-Lysin-Tropfen, um ein "Sandwich" zu machen. Dann reiben Sie die Rutschen ein paar Mal sanft, um die gesamte Oberfläche von beidem zu befeuchten und lassen Sie sie für 30 min an der Luft trocknen. Beschriften Sie die mattierte Seite der Dias mit Bleistift.
      ANMERKUNG: 0,2% Poly-L-Lysin-Aliquots von 200 l wurden durch Auflösen des Pulvers in dH₂O hergestellt; diese kann bei -20 °C gelagert werden. Verwenden Sie hochmolekulares Poly-L-Lysin zur verbesserungsfreien Kleben der Würmer. Die Konzentration von Poly-L-Lysin ist ebenfalls kritisch. Zu niedrige Konzentrationen lassen Würmer nicht haften, aber zu hohe Konzentrationen können Fluoreszenz-Hintergrundsignal erzeugen. Ein zu dicker Film kann sich in seiner Gesamtheit auflockern.
   2. Legen Sie einen flachen Metallblock fest auf den Boden eines Behälters(z.B. einen Polystyrolbehälter), der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.
      HINWEIS: Man kann stattdessen Trockeneis verwenden, aber flüssiger Stickstoff hält einen Metallblock stabiler auf dem Behälterboden und kühlt gut.
   3. Sammeln Sie Würmer entweder, indem Sie sie mit M9 von ihren Tellern waschen oder verschiedene Bühnenwürmer (entweder Eier, L1, L2, L3 oder L4 Larvenwirbel) auf jede Rutsche pflücken. In der Regel wählen Sie 100 Larven und Embryonen oder 20 Erwachsene auf jede Folie. Legen Sie 10 l abgewaschene Würmer auf die Mitte des Dias oder pflücken Sie Eier/Würmer in 10 l M9 oder 10 l 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline).
      1. Verwenden Sie eine Pipette, um eine große Anzahl von Würmern zu verteilen, um Klumpen bildung zu vermeiden.
         Hinweis: Gemischte Populationen von abgewaschenen Würmern, aufgrund von Gedränge und unterschiedlicher Dicke der Stufen, kleben nicht gut und sind weniger effektiv gefriercrackiert (siehe unten), daher liefert die Auswahl von stufenspezifischen Würmern (oder synchronisierten Populationen) überlegene Ergebnisse. Larven kleben besser als Erwachsene und mehr Tiere können pro Rutsche platziert werden.
      2. Bevor Sie Würmer auf Dias pflücken, übertragen Sie sie auf eine Nematode Growth Medium (NGM) Platte ohne OP50-Bakterien. Überschüssige Bakterien, die an den Würmern haften, können auch das Kleben stören. Achten Sie darauf, dass Würmer nicht austrocknen.
   4. Legen Sie eine 22 mm × 22 mm Überdeckungskreuze vorsichtig über die gesammelten Würmer, so dass ihre Kanten auf mindestens einer Seite der Rutsche hängen. Drücken Sie vorsichtig, aber fest mit einem oder zwei Fingern auf den Deckelschlupf. Vermeiden Sie Scheren, die die Gewebeintegrität schädigen.
   5. Den Schlitten sofort und vorsichtig in flüssigem Stickstoff auf den Metallblock übertragen und ca. 5 min zum Einfrieren sitzen lassen. Dann "flick off" die Abdeckungslip in einem schnellen Zug mit der überhängenden Kante.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss entschlossen durchgeführt werden und während die Rutsche eingefroren ist, um "Cracking" der Nagelhaut zu erreichen. Achtung: Bitte beachten Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff die PSA-Richtlinien (Personal Protection Equipment).
   6. Tauchen Sie die gefriercrackierten Gleitet in ein Methanol-gefülltesGlas Coplin Glas für 5 min bei -20 °C. Dann in ein Aceton-gefülltesGlas Coplin Glas für weitere 5 min bei -20 °C übertragen.
      HINWEIS: Methanol und Aceton sollten vor der Anwendung mindestens 30 min in -20 °C gelagert werden. Nach der Fixierung können Dias bei -20 °C gelagert werden.
      VORSICHT: Methanol und Aceton sind giftig.
   7. Entfernen Sie die Dias aus dem Glas und lassen Sie sie vor der Verwendung bei Raumtemperatur (RT) an der Luft trocknen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC