Fryssprickning av nematoder: En metod för att exponera inre maskvävnader för färgning

Overview

Den här videon beskriver fryssprickor, en metod för att göra C. elegans vävnader tillgängliga för antikroppsfärgning genom att störa nagelbanden.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Zhang et al, C. elegans Tarm som modell för intercellulär Lumen Morphogenesis och In Vivo polariserade membranbiogenes på encellsnivå: Märkning av antikroppsfärgning, RNAi-förlust av funktionsanalys och avbildning, J. Vis. Exp. (2017).

Antikroppsfärgning av C. elegans tarmen

1. Fixering
   1. Ta en ren glasrutschbana och använd poly-L-lysin för att generera en tunn film för maskar att hålla fast vid. Placera 30 μL 0,1-0,2% poly-L-lysin på bilden och placera en andra bild på poly-L-lysindroppe för att göra en "smörgås". Gnugga sedan bilderna försiktigt några gånger för att blöta hela ytorna på båda och låt dem lufttorka i 30 minuter. Märk den frostade sidan av diabilderna med blyertspenna.
      OBS: 0,2% poly-L-lysin alikvoter på 200 μL gjordes genom upplösning av pulvret i dH₂O; Detta kan förvaras vid -20 °C. Använd poly-L-lysin med hög molekylvikt för förbättrad stickning av maskarna. Koncentrationen av poly-L-lysin är också kritisk. För låga koncentrationer tillåter inte maskar att hålla fast men för höga koncentrationer kan generera fluorescensbakgrundssignal. En för tjock film kan lossna i sin helhet.
   2. Placera ett plant metallblock ordentligt på botten av en behållare(t.ex. en polystyrenbehållare) fylld med flytande kväve.
      OBS: Man kan använda torris istället, men flytande kväve håller ett metallblock stabilare på behållarens botten och kyler bra.
   3. Samla maskar antingen genom att tvätta dem från sina tallrikar med M9 eller plocka olika scenmaskar (antingen ägg, L1, L2, L3 eller L4 larvstegmaskar) på varje bild. Välj vanligtvis ~ 100 larver och embryon eller ~ 20 vuxna till varje bild. Placera 10 μL tvättade maskar i mitten av diabilden eller plocka ägg/maskar i 10 μL M9 eller 10 μL 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
      1. Använd en pipett för att sprida ut ett stort antal maskar för att undvika klumpar.
         Obs: Blandade populationer av tvättade maskar, på grund av trängsel och olika tjocklek på stadier, håller sig inte bra och är mindre effektivt frysspäckade (se nedan), därför ger plockning scenspecifika maskar (eller synkroniserade populationer) överlägsna resultat. Larver fastnar bättre än vuxna och fler djur kan placeras per bild.
      2. Innan du plockar maskar på diabilder, överför dem till en Nematod Growth Medium (NGM) platta utan OP50-bakterier. Överskott av bakterier som klibbar vid maskarna kan också störa klibbning. Se till att maskarna inte torkar ut.
   4. Placera försiktigt (droppe) en 22 mm × 22 mm täckglass tvärs över de insamlade maskarna så att dess kanter hänger över på minst ena sidan av bilden. Tryck rakt ner försiktigt men stadigt med en eller två fingrar på täcket. Undvik savning som skadar vävnadens integritet.
   5. Överför omedelbart och försiktigt glidningen till metallblocket i flytande kväve och låt den sitta i ca 5 minuter för att frysa. Sedan "snärta av" täckglaset i ett snabbt drag genom att använda den överhängande kanten.
      OBS: Detta steg måste göras beslutsamt och medan bilden är frusen för att uppnå "sprickbildning" av nagelbandet. Varning: Följ PPE-riktlinjerna (personalskyddsutrustning) när du arbetar med flytande kväve.
   6. Sänk ner de frysspäckade rutschkanorna i enmetanolfylld Coplinburk i 5 min vid -20 °C. Överför sedan till en acetonfylldcoplinburk i glas i ytterligare 5 minuter vid -20 °C.
      OBS: Metanol och aceton ska förvaras i -20 °C i minst 30 minuter före användning. Efter fixering kan bilder lagras vid -20 °C.
      VARNING: Metanol och aceton är giftiga.
   7. Ta bort diabilder från burken och låt dem lufttorka vid rumstemperatur (RT) före användning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
M9 Medium			lab made
OP50 bacteria	CGC