C. elegans Gonad Extrusion: Une technique de dissection rapide

Overview

Cette vidéo décrit une méthode pour disséquer les oisons des hermaphrodites adultes de C. elegans, ayant pour résultat des tissus qui conviennent à l’immunostaining et à l’imagerie fluorescente.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Gervaise and Arur, Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).

1. Dissection des vers adultes pour l’obtention de 9ds

1. Choisissez 100 à 150 WT (N2) ou le génotype désiré de vers au stade de développement désiré et spécifique (L1, L2, L3, L4, adulte, etc.)dans 100 μL de tampon M9 dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
2. Remplissez le tube de microcentrifugeuse de 900 μL de tampon M9 (voir tableau des matériaux). Centrifuger les tubes à 1 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min à température ambiante.
3. Retirer délicatement 900 μL du tampon M9 et les jeter. Retirez le tampon sous un microscope disséquant pour vous assurer que les vers ne sont pas enlevés accidentés.
4. Répétez les étapes 1.2 - 1.3 deux fois de plus avec le tampon M9 frais à chaque fois. Cela garantit que toutes les bactéries qui ont été transportées avec les vers sont effectivement emportées.
5. Après le lavage final, retirer 900 μL de tampon M9 du tube et jeter.
6. Transférer les 100 μL restants de tampon M9 contenant les 100 à 150 vers avec une pointe de 200 μL-micropipette dans un plat plat de montre en verre inférieur. Assurez-vous que la pointe de micropipette est coupée à la marque de 10 μL avant utilisation. Ne pas couper la pointe entraînera le cisaillement des vers.
7. Ajouter 1 à 3 μL de levamisole de 0,1 M au plat de montre en verre contenant les vers dans le tampon M9. Faites tourbillonner doucement le levamisole et le M9 pour permettre même le mélange jusqu’à ce que les vers cessent de bouger.
   REMARQUE: Les stocks de levamisole peuvent être stockés à -20 °C pour le stockage à long terme. Ici, utilisez la concentration plus élevée de 1 à 3 mM que ce qui a été décrit dans la littérature23 de 0,2 à 0,25 mM de levamisole afin d’obtenir une perte rapide de mobilité chez les animaux. Si les animaux s’écorchent trop longtemps dans la suspension liquide, les modèles résultants de dpERK dans les 90 peuvent être variables (en raison du stress ou du manque de nutrition ou des deux). Des modèles de coloration plus reproductibles ont été atteints avec 1 - 3 mM de levamisole pour la dissection.
8. Fixez deux aiguilles de 25 G à deux seringues de 1 mL (la taille de la seringue n’a pas d’importance, la jauge de l’aiguille est critique). Placez une seringue dans chaque main (Figure 1).
9. Sous un microscope disséquant, placez chaque aiguille sous et au-dessus de chaque ver comme le montre la figure 1 et placez une coupe fine sur le ver près du deuxième bulbe pharyngéal dans un mouvement de ciseaux. Après une coupe dans le ver passer à l’animal suivant jusqu’à ce que tous les animaux dans le plat ont été coupés au moins une fois.
   REMARQUE: N’oubliez pas que les étapes 1.8 - 1.9 sont sensibles au temps. Disséquer tous les vers dans le plat en moins de cinq minutes pour un motif reproductible dpERK. Des temps de dissection plus longs entraîneront l’éteignement du signal dpERK, en particulier dans la zone 1. Ajuster le nombre de vers par cycle de dissection(c.-à-d.50 vers contre 150) si nécessaire pour rester dans le délai imparti.
   1. Dans le cas où une 9ine extrudé n’est pas visible pendant la dissection, ne tentez pas une autre coupe chez le même animal. Habituellement, cela ne fait que cisailler l’animal et ne pas entraîner l’extrusion de la 9e. Passez plutôt à l’animal suivant. Les vers où les 9ds n’extrudnt pas apparaîtront en tant que tels sur les diapositives qui seront faites dans la section 6 et peuvent être ignorés pendant l’imagerie
      REMARQUE: À travers toutes les étapes de dissection et de traitement, il est important de garder à l’esprit que la 9ide restera attachée au corps/carcasse. Ne forcez pas la 9e et le corps séparés avec l’aiguille. Souvent, une déchirure aberrante dans le tissu gonadal dans une tentative de couper la 9ade du corps peut entraîner un faux signal d’anticorps. Le corps/carcasse peut être ignoré pendant les étapes d’imagerie, et seulement la médina photographiée. En outre, parfois les cellules intestinales peuvent également servir de contrôles internes / contrôles somatiques pour l’anticorps en cours d’analyse.

Figure 1 : Démonstration des positions des aiguilles pendant les dissections. Gauche : Photographie d’une dissection en cours. Droite : Positions de l’aiguille en référence au ver. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.