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Encyclopedia of Experiments

C. elegans Gonad Extrusion: Eine schnelle Dissektionstechnik

Overview

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Dissektierung von Gonaden aus erwachsenen C. elegans hermaphrodites, was zu Geweben führt, die für Immunostaining und fluoreszierende Bildgebung geeignet sind.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Gervaise und Arur, Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der C. elegans GermlineJ. Vis. (2016).

1. Dissektion von erwachsenen Würmern für die Beschaffung von Gonaden

  1. Wählen Sie 100 - 150 WT (N2) oder den gewünschten Genotyp von Würmern in der gewünschten und spezifischen Entwicklungsstufe (L1, L2, L3, L4, Erwachsene, etc.)in 100 l M9-Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  2. Füllen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit 900 L M9-Puffer (siehe Materialtabelle). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 1 min bei Umgebungstemperatur.
  3. Entfernen Sie vorsichtig 900 L des M9-Puffers und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie den Puffer unter einem Sezierendes Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Würmer nicht versehentlich entfernt werden.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 - 1.3 zwei weitere Male mit frischem M9-Puffer jedes Mal. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Bakterien, die mit den Würmern übertragen wurden, effektiv weggespült werden.
  5. Nach der Endwäsche 900 l M9-Puffer aus dem Rohr entfernen und entsorgen.
  6. Übertragen Sie die restlichen 100 L M9-Puffer, die die 100 - 150 Würmer mit einer 200-L-Mikropipette-Spitze enthalten, auf eine flache Glasuhrschale. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette-Spitze vor der Verwendung auf die 10-L-Marke geschnitten wird. Wenn Sie die Spitze nicht schneiden, wird die shearing der Würmer.
  7. Der Glasuhrschale, die die Würmer im M9-Puffer enthält, 1 - 3 l von 0,1 M Levamisol hinzufügen. Wirbeln Sie die Levamisole und den M9 vorsichtig, um ein gleichmäßiges Mischen zu ermöglichen, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen.
    HINWEIS: Levamisol-Bestände können bei -20 °C zur Langzeitlagerung gelagert werden. Hier verwenden Sie die höhere Konzentration von 1 - 3 mM als das, was in der Literatur beschrieben wurde23 von 0,2 - 0,25 mM Levamisol, um einen schnellen Verlust an Mobilität bei den Tieren zu erreichen. Wenn die Tiere zu lange in der Flüssigkeitssuspension herumlaufen, können die resultierenden Muster von dpERK in den Gonaden variabel sein (aufgrund von Stress oder Mangel an Nahrung oder beides). Mit 1 - 3 mM Levamisol zur Zerlegung wurden reproduzierbarere Färbemuster erreicht.
  8. Befestigen Sie zwei 25 G Nadeln an zwei 1 ml Spritzen (die Größe der Spritze spielt keine Rolle, das Messgerät der Nadel ist entscheidend). Positionieren Sie eine Spritze in jeder Hand (Abbildung 1).
  9. Positionieren Sie unter einem Sezierendes Mikroskop jede Nadel unter und über jedem Wurm, wie in Abbildung 1 dargestellt, und legen Sie einen feinen Schnitt auf den Wurm in der Nähe der zweiten Rachenkugel in einer scherenartigen Bewegung. Nach einem Schnitt im Wurm zum nächsten Tier, bis alle Tiere in der Schale mindestens einmal geschnitten sind.
    HINWEIS: Beachten Sie, dass die Schritte 1.8 - 1.9 zeitempfindlich sind. Sezieren Sie alle Würmer in der Schale in weniger als fünf min für ein reproduzierbares dpERK-Muster. Längere Sezierzeiten führen zu einem Abschalten des dpERK-Signals, insbesondere in Zone 1. Passen Sie die Anzahl der Würmer pro Sezierrunde(d. h.50 Würmer vs. 150) bei Bedarf an, um im zugewiesenen Zeitrahmen zu bleiben.
    1. Falls ein extrudierter Gonaden während der Zerlegung nicht sichtbar ist, versuchen Sie nicht, ein weiteres Tier zu schneiden. In der Regel wird das nur das Tier scheren und nicht in Extrusion der Gonade führen. Gehen Sie stattdessen zum nächsten Tier. Würmer, bei denen die Gonaden nicht extrudieren, erscheinen als solche auf den Dias, die in Abschnitt 6 gemacht werden und während der Bildgebung ignoriert werden können.
      HINWEIS: Bei allen Sezier- und Verarbeitungsschritten ist es wichtig zu bedenken, dass der Gonaden am Körper/Kadaver befestigt bleibt. Zwingen Sie den Gonaden und den Körper nicht mit der Nadel auseinander. Oft kann ein abwegiger Riss im Gonadengewebe bei dem Versuch, den Gonaden vom Körper zu trennen, zu einem falschen Antikörpersignal führen. Der Körper/Kadaver kann während der Bildschritte ignoriert werden, und nur die Gonade abgebildet. Darüber hinaus können manchmal die Darmzellen auch als interne Kontrollen/somatische Kontrollen für den Antikörper dienen, der untersucht wird.

Figure 1
Abbildung 1: Demonstration von Nadelpositionen während der Sezierungen. Links: Foto einer Zerlegung im Prozess. Rechts: Nadelpositionen in Bezug auf den Wurm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.

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Quelle: Gervaise, A. L. and Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. (2016).

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