C. एलिगेंस गोनाड एक्सट्रूशन: एक रैपिड विच्छेदन तकनीक

Overview

यह वीडियो वयस्क सी एलिगेंस हर्मेफ्रोडाइट्स से गोनाड को विच्छेदन करने की विधि का वर्णन करता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक होते हैं जो इम्यूनोदाते और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए उपयुक्त होते हैं।

Protocol

यह प्रोटोकॉल गेर्वाज़ और अरूर, स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण से एक अंश है जो सी एलिगेंस जर्मलाइन में सक्रिय ईआरके काहै। जे विस एक्सप्रेस। (2016).

1. गोनाड प्राप्त करने के लिए वयस्क कीड़े का विच्छेदन

1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंटरफ्यूज ट्यूब में एम 9 बफर के 100 माइक्रोल में वांछित और विशिष्ट विकासात्मक चरण (एल 1, एल 2, एल 3, एल 4, वयस्क, आदि) में वांछित और विशिष्ट विकासात्मक चरण (एल 1, एल 2, एल 3, एल 4, वयस्क, आदि)पर कीड़े के 100 - 150 डब्ल्यूटीटी (एन2) या वांछित जीनोटाइप चुनें।
2. M9 बफर के 900 माइक्रोल के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब भरें (सामग्री तालिकादेखें)। परिवेश के तापमान पर 1 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 1,000 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
3. धीरे-धीरे M9 बफर के 900 माइक्रोन निकालें और त्यागें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़े को दुर्घटनापूर्वक हटाया नहीं जाता है, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे बफर निकालें।
4. हर बार ताजा M9 बफर के साथ कदम 1.2 - 1.3 दो बार दोहराएं। यह सुनिश्चित करता है कि कीड़े के साथ किए गए किसी भी बैक्टीरिया को प्रभावी ढंग से धोया जाता है।
5. अंतिम धोने के बाद ट्यूब से M9 बफर के 900 माइक्रोन निकालें और त्यागें।
6. 100 - 150 कीड़े वाले 100 माइक्रोपिपेट टिप के साथ 100 माइक्रोपिपेट टिप वाले एम 9 बफर के शेष 100 माइक्रोल को एक फ्लैट बॉटम ग्लास वॉच डिश में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग से पहले माइक्रोपिपेट टिप को 10 माइक्रोल मार्क पर काटा गया है। टिप नहीं काटने से कीड़े के कतरन में परिणाम होगा।
7. M9 बफर में कीड़े युक्त ग्लास वॉच डिश में 0.1 एम लेवेमिसोल के 1 - 3 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे लेविसोल और एम 9 को तब तक मिश्रण करने में सक्षम बनाने के लिए घूमता है जब तक कि कीड़े आगे बढ़ना बंद न कर दें।
   नोट: लेवामिसोल स्टॉक को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यहां, जानवरों में गतिशीलता की तेजी से हानि प्राप्त करने के लिए 0.2 - 0.25 m m levamisole के साहित्य 23 में वर्णित की तुलना में 1 - 3 mm की उच्च एकाग्रता का उपयोग करें। यदि तरल निलंबन में जानवर बहुत लंबे समय तक चारों ओर जाते हैं, तो गोनाड में डीपीईआरके के परिणामस्वरूप पैटर्न परिवर्तनीय हो सकते हैं (तनाव या पोषण या दोनों की कमी के कारण)। विच्छेदन के लिए 1 - 3 एमएल लेविमिसोल के साथ अधिक प्रजनन धुंधला पैटर्न प्राप्त किया गया है।
8. दो 1 मिली सीरिंज के लिए दो 25 जी सुई संलग्न (सिरिंज के आकार कोई फर्क नहीं पड़ता, सुई का गेज महत्वपूर्ण है) । प्रत्येक हाथ में एक सिरिंज की स्थिति(चित्रा 1)।
9. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक सुई के नीचे और प्रत्येक कीड़ा के ऊपर की स्थिति के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है और एक कैंची की तरह गति में दूसरे pharyngeal बल्ब के पास कीड़ा पर एक ठीक कटौती जगह है । कीड़ा में एक कट के बाद अगले जानवर पर चलते हैं जब तक कि पकवान में सभी जानवरों को कम से कम एक बार काटा नहीं गया है।
   नोट: ध्यान रखें कि चरण 1.8 - 1.9 समय संवेदनशील हैं। एक प्रजनन योग्य dpERK पैटर्न के लिए पांच मिनट के तहत में पकवान में सभी कीड़े विच्छेदन। अब विच्छेदन समय के परिणामस्वरूप डीपीईआरके सिग्नल का एक मोड़ होगा, विशेष रूप से जोन 1 में। आवंटित समय सीमा में रहने के लिए आवश्यक होने पर विच्छेदन के प्रति दौर(यानी,50 कीड़े बनाम 150) कीड़े की संख्या को समायोजित करें।
   1. यदि विच्छेदन के दौरान एक बाहरी गोनाड दिखाई नहीं देता है, तो एक ही जानवर में एक और कटौती का प्रयास न करें। आमतौर पर है कि केवल जानवर कतरनी और गोनाड के बाहर निकालना में परिणाम नहीं होगा। इसके बजाय, अगले जानवर पर जाएं। कीड़े जहां गोनाड बाहर नहीं निकलते हैं, वे स्लाइड्स पर ऐसे दिखाई देंगे जो धारा 6 में बनाए जाएंगे और इमेजिंग के दौरान नजरअंदाज किया जा सकता है
      नोट: सभी विच्छेदन और प्रसंस्करण चरणों के माध्यम से, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि गोनाड शरीर/शव से जुड़ा रहेगा । सुई के साथ गोनाड और शरीर को अलग न करें। अक्सर शरीर से गोनाड को तोड़ने के प्रयास में गोनाडल ऊतक में एक गुमराह आंसू नकली एंटीबॉडी संकेत में परिणाम कर सकते हैं। शव/शव इमेजिंग चरणों के दौरान नजरअंदाज किया जा सकता है, और केवल गोनाड इमेज्ड । इसके अतिरिक्त, कभी-कभी आंतों की कोशिकाएं एंटीबॉडी को परखने के लिए आंतरिक नियंत्रण/दैहिक नियंत्रण के रूप में भी काम कर सकती हैं।

चित्रा 1: विच्छेदन के दौरान सुई पदों का प्रदर्शन। बाएं: प्रक्रिया में एक विच्छेदन की तस्वीर । सही: कीड़ा के संदर्भ में सुई की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.