C. elegans Estrusione gonade: una tecnica di dissezione rapida

Overview

Questo video descrive un metodo per sezionare le gonadi degli ermafroditi C. elegans adulti, con conseguente soluzione di tessuti adatti all'immunosocienza e all'imaging fluorescente.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Gervaise e Arur, Analisi spaziale e temporale dell'ERK attiva nella linea germinale C. elegans . J. Vis. Exp. (2016).

1. Dissezione di vermi adulti per ottenere gonadi

1. Scegliere 100 - 150 WT (N2) o genotipo desiderato di vermi nella fase di sviluppo desiderata e specifica (L1, L2, L3, L4, adulto, ecc.)in 100 μL di tampone M9 in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
2. Riempire il tubo di microcentrifugo con 900 μL di tampone M9 (vedere Tabella materiali). Centrifugare i tubi a 1.000 x g in un microcentrifugo per 1 min a temperatura ambiente.
3. Rimuovere delicatamente 900 μL del tampone M9 e scartare. Rimuovere il buffer al microscopio di sezionamento per assicurarsi che i worm non vengano rimossi accidentalmente.
4. Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.3 altre due volte con un buffer M9 fresco ogni volta. Ciò garantisce che tutti i batteri trasportati con i vermi siano effettivamente lavati via.
5. Dopo il lavaggio finale rimuovere 900 μL di tampone M9 dal tubo e scartare.
6. Trasferire i restanti 100 μL di tampone M9 contenenti i 100 - 150 vermi con una punta da 200 μL-micropipette su una piastra di vetro inferiore piatto. Assicurarsi che la punta della micropipetta sia tagliata al segno di 10 μL prima dell'uso. Il non taglio della punta comporterà la tranciatura dei vermi.
7. Aggiungere 1 - 3 μL di levamisolo da 0,1 M al piatto dell'orologio di vetro contenente i vermi nel tampone M9. Ruotare delicatamente il levamisolo e l'M9 per consentire anche la miscelazione fino a quando i vermi non smettono di muoversi.
   NOTA: Le scorte di levamisolo possono essere conservate a -20 °C per lo stoccaggio a lungo termine. Qui, utilizzare la maggiore concentrazione di 1 - 3 mM rispetto a quanto descritto in letteratura23 di 0,2 - 0,25 mM di levamisolo per ottenere una rapida perdita di mobilità negli animali. Se gli animali si aggirano troppo a lungo nella sospensione liquida, i modelli risultanti di dpERK nelle gonadi possono essere variabili (a causa dello stress o della mancanza di nutrizione o di entrambi). Sono stati ottenuti modelli di colorazione più riproducibili con levamisolo da 1 a 3 mM per la dissezione.
8. Attaccare due aghi da 25 G a due siringhe da 1 ml (la dimensione della siringa non ha importanza, il calibro dell'ago è fondamentale). Posizionare una siringa in ciascuna mano (Figura 1).
9. Al microscopio sezionato, posizionare ogni ago sotto e sopra ogni verme, come mostrato nella figura 1, e posizionare un taglio fine sul verme vicino al secondo bulbo faringeo in un movimento simile a una forbice. Dopo un taglio nel verme passare all'animale successivo fino a quando tutti gli animali nel piatto sono stati tagliati almeno una volta.
   NOTA: Tenere presente che i passaggi da 1.8 a 1.9 sono sensibili al tempo. Sezionare tutti i vermi nel piatto in meno di cinque minuti per un modello dpERK riproducibile. Tempi di dissezione più lunghi si tradurranno in uno spegnimento del segnale dpERK, specialmente nella Zona 1. Regolare il numero di vermi per tondo di dissezione(ad esempio,50 vermi contro 150) se necessario per rimanere nel periodo di tempo assegnato.
   1. Nel caso in cui un gonade estruso non sia visibile durante la dissezione, non tentare un altro taglio nello stesso animale. Di solito ciò tagliorà solo l'animale e non comporterà l'estrusione del gonad. Invece, passa al prossimo animale. I worm in cui le gonadi non estrudono appariranno come tali nelle diapositive che verranno effettuate nella sezione 6 e possono essere ignorate durante l'imaging
      NOTA: Attraverso tutte le fasi di dissezione ed elaborazione, è importante tenere presente che il gonad rimarrà attaccato al corpo / carcassa. Non forzare il gonad e il corpo a parte con l'ago. Spesso una lacrima aberrante nel tessuto gonadale nel tentativo di severare il gonade dal corpo può causare un segnale anticorpale spurio. Il corpo /carcassa può essere ignorato durante i passaggi di imaging e solo il gonad è stato immaginato. Inoltre, a volte le cellule intestinali possono anche servire come controlli interni / controlli somatici per l'anticorpo che viene analizzato.

Figura 1: Dimostrazione delle posizioni degli aghi durante le dissezioni. A sinistra: Fotografia di una dissezione in corso. A destra: posizioni dell'ago con riferimento al verme. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.