C. elegans Gonad ekstrudering: En rask disseksjonsteknikk

Overview

Denne videoen beskriver en metode for å dissekere gonader fra voksne C. elegans hermafroditter, noe som resulterer i vev som er egnet for immunstaining og fluorescerende avbildning.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Gervaise og Arur, Spatial og Temporal Analyse av Active ERK i C. elegans Germline. J. Vis. Utt. (2016).

1. Disseksjon av voksne ormer for å skaffe gonader

1. Velg 100 - 150 WT (N2) eller ønsket genotype av ormer på ønsket og spesifikk utviklingsstadium (L1, L2, L3, L4, voksen, etc.) i 100 μL M9 buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
2. Fyll mikrosentrifugerøret med 900 μL M9 buffer (se Materialtabell). Sentrifuger rørene på 1000 x g i en mikrosenter i 1 min ved omgivelsestemperatur.
3. Fjern forsiktig 900 μL av M9-bufferen og kast den. Fjern bufferen under et dissekeringsmikroskop for å sikre at ormene ikke fjernes ved et uhell.
4. Gjenta trinn 1.2 - 1.3 to ganger til med fersk M9-buffer hver gang. Dette sikrer at eventuelle bakterier som ble båret over med ormene, effektivt vaskes bort.
5. Etter den endelige vasken fjern 900 μL M9 buffer fra røret og kast.
6. Overfør de resterende 100 μL M9-bufferen som inneholder 100 - 150 ormer med en 200 μL-mikropipettespiss til en flat klokkefat i bunnglass. Påse at mikropipettespissen kuttes ved 10 μL-merket før bruk. Ikke kutting av spissen vil resultere i skjæring av ormene.
7. Tilsett 1 - 3 μL 0,1 M levamisol i glassklokkefatet som inneholder ormene i M9-bufferen. Virvle forsiktig levamisolen og M9 for å gjøre det mulig å blande til ormene slutter å bevege seg.
   MERK: Levamisolbestandene kan oppbevares ved -20 °C for langtidslagring. Her bruker du den høyere konsentrasjonen på 1 - 3 mM enn det som er beskrevet i litteratur23 av 0,2 - 0,25 mM levamisol for å oppnå raskt tap av mobilitet hos dyrene. Hvis dyrene flay rundt for lenge i væske suspensjon, kan de resulterende mønstrene av dpERK i gonadene være variable (på grunn av stress eller mangel på ernæring eller begge deler). Mer reproduserbare fargemønstre er oppnådd med 1 - 3 mM levamisol for disseksjon.
8. Fest to 25 G nåler til to 1 ml sprøyter (størrelsen på sprøyten spiller ingen rolle, nålens måler er kritisk). Plasser én sprøyte i hver hånd (figur 1).
9. Under et dissekerende mikroskop plasserer du hver nål under og over hver orm som vist i figur 1 og legger et fint kutt på ormen nær den andre faryngealpæren i en sakslignende bevegelse. Etter ett kutt i ormen går videre til neste dyr til alle dyrene i parabolen er kuttet minst en gang.
   MERK: Vær oppmerksom på at trinn 1.8 - 1.9 er tidssensitive. Disseker alle ormer i parabolen på under fem minutter for et reproduserbart dpERK-mønster. Lengre disseksjonstider vil føre til at dpERK-signalet slås av, spesielt i sone 1. Juster antall ormer per runde med disseksjon (dvs.50 ormer vs. 150) om nødvendig for å holde seg i den tildelte tidsrammen.
   1. I tilfelle en ekstrudert gonad ikke er synlig under disseksjonen, ikke prøv et nytt kutt i samme dyr. Vanligvis vil det bare skjære dyret og ikke resultere i ekstrudering av gonaden. Gå i stedet videre til neste dyr. Ormer der gonadene ikke ekstruderer, vises som sådan på lysbildene som vil bli laget i del 6 og kan ignoreres under bildebehandling
      MERK: Gjennom alle disseksjons- og behandlingstrinnene er det viktig å huske på at gonad vil forbli festet til kroppen / slaktkroppen. Ikke tving gonad og kroppen fra hverandre med nålen. Ofte kan en avvikende tåre i gonadalvevet i et forsøk på å kutte gonad fra kroppen føre til falske antistoffsignaler. Kroppen/slaktkroppen kan ignoreres under bildebehandlingstrinnene, og bare gonad avbildes. I tillegg kan tarmcellene noen ganger også fungere som interne kontroller / somatiske kontroller for antistoffet som blir analysert.

Figur 1: Demonstrasjon av nåleposisjoner under disseksjoner. Venstre: Fotografi av en disseksjon i gang. Høyre: Nåleposisjoner med referanse til ormen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.