C. elegans Extrusão de Gonad: Uma Técnica de Dissecção Rápida

Overview

Este vídeo descreve um método para dissecar gônds de hermafroditas C. elegans adultas, resultando em tecidos adequados para imunossagens e imagens fluorescentes.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Gervaise e Arur, Análise Espacial e Temporal da ERK Ativa na C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (2016).

1. Dissecção de Vermes Adultos para Obtenção de Gôndas

1. Escolha 100 - 150 WT (N2) ou genótipo desejado de worms no estágio de desenvolvimento desejado e específico (L1, L2, L3, L4, adulto, etc.)em 100 μL de tampão M9 em um tubo de microcentrifuagem de 1,5 mL.
2. Encha o tubo de microcentrifutura com 900 μL de tampão M9 (ver Tabela de Materiais). Centrifugar os tubos a 1.000 x g em uma microcentrifuagem por 1 min a temperatura ambiente.
3. Remova suavemente 900 μL do buffer M9 e descarte. Remova o buffer sob um microscópio de dissecação para garantir que os worms não sejam removidos acidentalmente.
4. Repita as etapas 1.2 - 1,3 mais duas vezes com tampão M9 fresco cada vez. Isso garante que todas as bactérias que foram transportadas com os vermes sejam efetivamente lavadas.
5. Após a lavagem final, remova 900 μL de tampão M9 do tubo e descarte.
6. Transfira os 100 μL restantes do tampão M9 contendo os 100 - 150 worms com uma ponta de 200 μL-micropipette para um prato de relógio de vidro inferior plano. Certifique-se de que a ponta da micropipette seja cortada na marca de 10 μL antes de usar. Não cortar a ponta resultará na corte dos vermes.
7. Adicione 1 - 3 μL de 0,1 M de levamisole ao prato de relógio de vidro contendo os vermes no tampão M9. Gire suavemente o levamisole e o M9 para permitir a mistura até que os vermes parem de se mover.
   NOTA: Os estoques de levamisole podem ser armazenados a -20 °C para armazenamento a longo prazo. Aqui, utilize a maior concentração de 1 - 3 mM do que o descrito na literatura23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisole, a fim de obter rápida perda de mobilidade nos animais. Se os animais esfolar por muito tempo na suspensão líquida, os padrões resultantes de dpERK nas gôngas podem ser variáveis (devido ao estresse ou falta de nutrição ou ambos). Padrões de coloração mais reprodutíveis foram alcançados com 1 - 3 mM de levamisole para dissecção.
8. Anexar duas agulhas de 25 G a duas seringas de 1 mL (o tamanho da seringa não importa, o medidor da agulha é crítico). Posicione uma seringa em cada mão(Figura 1).
9. Sob um microscópio dissecando, posicione cada agulha sob e sobre cada verme como mostrado na Figura 1 e coloque um corte fino no verme perto da lâmpada faringeal em um movimento semelhante a uma tesoura. Depois de um corte no verme passar para o próximo animal até que todos os animais no prato tenham sido cortados pelo menos uma vez.
   NOTA: Tenha em atenção que as etapas 1.8 - 1.9 são sensíveis ao tempo. Disseque todos os vermes no prato em menos de cinco minutos para um padrão de dpERK reprodutível. Tempos de dissecção mais longos resultarão em um desligamento do sinal dpERK, especialmente na Zona 1. Ajuste o número de vermes por rodada de dissecção (ou seja,50 worms vs. 150) se necessário para permanecer no período de tempo atribuído.
   1. Caso uma gônada extrudada não seja visível durante a dissecção, não tente outro corte no mesmo animal. Normalmente isso só vai tesourar o animal e não resultar em extrusão da gônus. Em vez disso, passe para o próximo animal. Vermes onde as gônadas não extrudam aparecerão como tal nos slides que serão feitos na seção 6 e podem ser ignorados durante a imagem
      NOTA: Através de todas as etapas de dissecção e processamento, é importante ter em mente que a gônada permanecerá presa ao corpo/carcaça. Não force a gônada e o corpo com a agulha. Muitas vezes uma ruptura aberrante no tecido gonadal na tentativa de cortar a gônada do corpo pode resultar em sinal de anticorpo espúrio. O corpo/carcaça pode ser ignorado durante as etapas de imagem, e apenas a gônada imagem. Além disso, às vezes as células intestinais também podem servir como controles internos/controles somáticos para o anticorpo que está sendo avaliado.

Figura 1: Demonstração de Posições de Agulha durante as dissecções. Esquerda: Fotografia de uma dissecação em processo. Direito: Posições de agulha com referência ao verme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.