C. elegans Extrusión de Gonad: una técnica de disección rápida

Overview

Este video describe un método para diseccionar gónadas de hermafroditas C. elegans adultas, lo que resulta en tejidos que son adecuados para la inmunodetección y las imágenes fluorescentes.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Gervaise y Arur, Análisis espacial y temporal de ERK activo en la línea C. elegans Germline. J. Vis. (2016).

1. Disección de gusanos adultos para obtener gónada

1. Elija 100 - 150 WT (N2) o genotipo deseado de gusanos en la etapa de desarrollo deseada y específica (L1, L2, L3, L4, adulto, etc.)en 100 μL de amortiguador M9 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Llene el tubo de microcentrífuga con 900 μL de amortiguador M9 (ver Tabla de materiales). Centrífuga los tubos a 1.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min a temperatura ambiente.
3. Retire suavemente 900 μL del tampón M9 y deseche. Retire el búfer bajo un microscopio de disección para asegurarse de que los gusanos no se eliminan accidentalmente.
4. Repita los pasos 1.2 - 1.3 dos veces más con búfer M9 fresco cada vez. Esto asegura que cualquier bacteria que se llevó con los gusanos se lave eficazmente.
5. Después del lavado final retire 900 μL de amortiguador M9 del tubo y deseche.
6. Transfiera los 100 μL restantes de amortiguador M9 que contengan los 100 - 150 gusanos con una punta de micropipette de 200 μL a una platillo de reloj de vidrio de fondo plano. Asegúrese de que la punta del micropipette se corte a la marca de 10 μL antes de su uso. No cortar la punta resultará en la cizallamiento de los gusanos.
7. Añadir 1 - 3 μL de levamisole de 0,1 M a la platina de reloj de vidrio que contiene los gusanos en amortiguador M9. Arremolina suavemente el levamisole y el M9 para permitir incluso la mezcla hasta que los gusanos dejen de moverse.
   NOTA: Las existencias de levamisole se pueden almacenar a -20 °C para almacenamiento a largo plazo. Aquí, utilice la concentración más alta de 1 - 3 mM que lo que se ha descrito en la literatura23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisole con el fin de obtener una rápida pérdida de movilidad en los animales. Si los animales se agitan durante demasiado tiempo en la suspensión líquida, los patrones resultantes de dpERK en las gónada pueden ser variables (debido al estrés o la falta de nutrición o ambos). Se han logrado patrones de tinción más reproducibles con levamisole de 1 a 3 mM para su disección.
8. Coloque dos agujas de 25 G en dos jeringas de 1 ml (el tamaño de la jeringa no importa, el medidor de la aguja es crítico). Coloque una jeringa en cada mano (Figura 1).
9. Bajo un microscopio diseccionador, coloque cada aguja debajo y sobre cada gusano como se muestra en la Figura 1 y coloque un corte fino en el gusano cerca de la segunda bombilla faríngea en un movimiento similar a una tijera. Después de un corte en el gusano pasar al siguiente animal hasta que todos los animales en el plato han sido cortados al menos una vez.
   NOTA: Tenga en cuenta que los pasos 1.8 - 1.9 son sensibles al tiempo. Disecciona todos los gusanos del plato en menos de cinco minutos para un patrón dpERK reproducible. Los tiempos de disección más largos darán lugar a un apagado de la señal dpERK, especialmente en la zona 1. Ajuste el número de gusanos por ronda de disección(es decir,50 gusanos frente a 150) si es necesario para permanecer en el marco de tiempo asignado.
   1. En caso de que una gónada extruida no sea visible durante la disección, no intente otro corte en el mismo animal. Por lo general, eso sólo cizallará al animal y no resultará en la extrusión de la gónada. En su lugar, pasar al siguiente animal. Los gusanos donde las gónadas no extruyen aparecerán como tales en las diapositivas que se harán en la sección 6 y pueden ser ignorados durante la toma de imágenes
      NOTA: A través de todos los pasos de disección y procesamiento, es importante tener en cuenta que la gónada permanecerá unida al cuerpo/cadáver. No forje la gónada y el cuerpo separados con la aguja. A menudo, un desgarro aberrante en el tejido gonadal en un intento de separar la gónada del cuerpo puede resultar en una señal de anticuerpos espurio. El cuerpo/canal se puede ignorar durante los pasos de imágenes, y solo la imagen de la gónada. Además, a veces las células intestinales también pueden servir como controles internos /controles somáticos para el anticuerpo que se está probando.

Figura 1: Demostración de posiciones de aguja durante las disecciones. Izquierda: Fotografía de una disección en proceso. Derecha: Posiciones de la aguja con referencia al gusano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.