C. elegans Gonad Ekstrüzyon: Hızlı Diseksiyon Tekniği

Overview

Bu videoda, yetişkin C. elegans hermafroditlerinden gonadları parçalamak için bir yöntem açıklanmaktadır, bu da immünostaining ve floresan görüntüleme için uygun dokularla sonuçlanır.

Protocol

Bu protokol, C. elegans Germline'daki Aktif ERK'nin Gervaise ve Arur, Mekansal ve Zamansal Analizi'nden bir alıntıdır. J. Vis. Exp. (2016).

1. Gonad Elde Etmek İçin Yetişkin Solucanların Diseksiyonu

1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 100 μL M9 tamponunda istenen ve spesifik gelişim aşamasında (L1, L2, L3, L4, yetişkin vb.)100 - 150 WT (N2) veya istenen solucan genotipini seçin.
2. Mikrosantrifüj tüpünü 900 μL M9 tampon ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosu). Tüpleri ortam sıcaklığında 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde 1.000 x g'da santrifüj edin.
3. M9 tamponunun 900 μL'lik kısmını yavaşça çıkarın ve atın. Solucanların yanlışlıkla çıkarılmamasını sağlamak için bir diseksiyon mikroskobu altındaki tamponu çıkarın.
4. Her seferinde taze M9 arabelleği ile 1.2 - 1.3 adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Bu, solucanlarla taşınan bakterilerin etkili bir şekilde yıkanmasını sağlar.
5. Son yıkamadan sonra tüpten 900 μL M9 tamponu çıkarın ve atın.
6. 200 μL mikropipette uçlu 100 - 150 solucanı içeren kalan 100 μL M9 tamponunu düz bir alt cam saat kabına aktarın. Mikropipette ucunun kullanmadan önce 10 μL işaretle kesildiğinden emin olun. Ucun kesilmemesi solucanların kesilmesine neden olur.
7. M9 tamponundaki solucanları içeren cam saat kabına 1 - 3 μL 0,1 M levamisole ekleyin. Solucanlar hareket etmeyi durdurana kadar karıştırmayı bile sağlamak için levamisole ve M9'ı hafifçe döndürün.
   NOT: Levamisole stokları uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir. Burada, hayvanlarda hızlı hareket kaybı elde etmek için literatürde açıklanandan 1 - 3 mM daha yüksek konsantrasyonu kullanın23 0.2 - 0.25 mM levamisole. Hayvanlar sıvı süspansiyonda çok uzun süre yüzerse, gonadlardaki dpERK'nın ortaya çıkan desenleri değişken olabilir (stres veya beslenme eksikliği veya her ikisi nedeniyle). Diseksiyon için 1 - 3 mM levamisole ile daha tekrarlanabilir boyama desenleri elde edilmiştir.
8. İki adet 1 mL şırıngaya iki adet 25 G iğne takın (şırınganın büyüklüğü önemli değildir, iğnenin göstergesi kritiktir). Her elde bir şırıng yerleştirin (Şekil 1).
9. Bir diseksiyon mikroskobu altında, şekil 1'de gösterildiği gibi her bir iğneyi her solucanın altına ve üzerine yerleştirin ve solucanın üzerine makas benzeri bir hareketle ikinci farengeal ampulün yanına ince bir kesik yerleştirin. Solucandaki bir kesimden sonra, tabaktaki tüm hayvanlar en az bir kez kesilene kadar bir sonraki hayvana geçin.
   NOT: 1.8 - 1.9 arası adımların zamana duyarlı olduğunu unutmayın. Tekrarlanabilir bir dpERK deseni için çanaktaki tüm solucanları beş dakikadan daha az bir sürede parçalara bölün. Daha uzun diseksiyon süreleri, özellikle Bölge 1'de dpERK sinyalinin kesilmesine neden olur. Ayrılan zaman diliminde kalmak için gerekirse, diseksiyon turu başına solucan sayısını(yani,50 solucana karşı 150) ayarlayın.
   1. Diseksiyon sırasında ekstrüde edilmiş bir gonad görülmemesi durumunda, aynı hayvanda başka bir kesme girişiminde bulunmayın. Genellikle bu sadece hayvanı yamyamlar ve gonad ekstrüzyona neden olmaz. Bunun yerine, bir sonraki hayvana geçin. Gonadların ekstrüde olmadığı solucanlar, bölüm 6'da yapılacak slaytlarda bu şekilde görünecek ve görüntüleme sırasında göz ardı edilebilecektir.
      NOT: Tüm diseksiyon ve işleme adımları boyunca, gonad'ın vücuda / karkasa bağlı kalacağını akılda tutulması önemlidir. Gonad ve vücudu iğne ile ayırmayın. Çoğu zaman gonadal dokusunda, gonad'ı vücuttan koparmak için anormal bir yırtık sahte antikor sinyaline neden olabilir. Görüntüleme adımları sırasında gövde/karkas göz ardı edilebilir ve yalnızca gonad görüntülenebilir. Ek olarak, bazen bağırsak hücreleri de test edilen antikor için iç kontroller / somatik kontroller olarak hizmet edebilir.

Şekil 1: Diseksiyonlar sırasında İğne Pozisyonlarının Gösterimi. Sol: İşlemdeki bir diseksiyonun fotoğrafı. Sağ: Solucana atıfta bulunularak iğne konumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.