Overview
במהלך הדמיה חיה של C. elegans, כרית agarose ניתן להשתמש כדי להחזיק את nematode עדיין מבלי לפגוע או לייבש אותו. וידאו זה מתאר כיצד להכין משטח הרכבה פשוט עבור מיקרוסקופיה.
Protocol
פרוטוקול זה מובא מתוך Teoh et al, גישות כמותיות לחקר מבנים תאיים ומורפולוגיה Organelle ב Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
הכנת שקופיות להדמיה
- הכן 3-4% עם מלאי agarose בבקבוק בטוח למיקרוגל (3-4 גרם ב 100 מ"ל של מים אולטרה סגולים).
שים לב: אגר יכול לשמש במקום agarose באותו ריכוז. - ממיסים את ההתעוררות בזהירות במיקרוגל, מקפידים לא להרתיח יתר על הים, עד שכל ההתעוררות מתמוססת (פתרון ברור). שמור על הפתרון ב 70 מעלות צלזיוס כדי למנוע התגבשות.
שים לב: ניתן להשתמש במלאי אגרוז מספר פעמים. מחממים לפני השימוש אם agarose התגבש. - באמצעות פיפטה פסטר, מקום טיפה של agarose מומס על שקופית מיקרוסקופ.
שים לב: הימנע מבועות אוויר בירידה של אגר כמו אלה לשבש את שלמות הפנקס. - מיד ללחוץ על טיפת agarose עם שקופית מיקרוסקופ אחרת, בעדינות לשטח את agarose לתוך כרית בין שתי שקופיות.
שים לב: יש להסיר את שאריות הבועות בשלב זה. אם לא, שקופיות חדשות צריך להיעשות כמו בעלי חיים יכולים בקלות להיתקע בבועות. הימנע מהצפת אגר לצד בעת לחיצה על השקופית. - השאירו את agarose להתייבש במשך 1 דקות.
- הפרד בזהירות בין שתי השקופיות כדי למנוע נזק לאגורה, תוך השארת הפנקס המוצק על אחת השקופיות.
שים לב: שקופיות עם רפידות agarose תמיד צריך להיות מוכן טרי רק לפני הניסוי כפי שהם יכולים להתייבש. ודא כרית agarose יש עובי עקבי. לא צריך להיות בועות אוויר או סדקים בכרית כמו זה עלול להפריע הדמיה. - הוסף טיפה קטנה (5-10 μL) של 0.05% טטרמיסולה הידרוכלוריד (הרדמה) למרכז כרית agarose.
- בעזרת פיק מעוקר בחום, מעבירים במהירות כ-10 - 15 בעלי חיים מלוחית המלאי לטיפת ההרדמה לפני שהפתרון מתייבש. הימנע העברת יותר מדי חיידקים OP50 כמו זה עושה את הפתרון מעונן, אשר יכול להפריע הדמיה.
שים לב: אם פתרון ההרדמה מתייבש בזמן הקטיף, פשוט פיפטה ירידה שנייה של 0.05% טטרמיסולה הידרוכלוריד על בעלי החיים. בעלי החיים נוטים לשכב על הצד הצדדי שלהם בתמיסת ההרדמה. - החל כיסוי על ידי מיקום אותו ממש מעל כרית agarose בעדינות להפיל אותו. זה ימנע היווצרות של בועות. אין להפעיל לחץ על הכיסוי שכן זה עלול למחוץ את בעלי החיים.
- סמן את השקופיות בשם המתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
