Overview
C.エレガンスのライブイメージング中に、アガロースパッドを使用して、線虫を損傷したり乾燥させたりすることなく、線虫を保持することができます。 このビデオでは、顕微鏡用の簡単な取り付けパッドを準備する方法について説明します。
Protocol
このプロトコルは、Teohらから抜粋され、ケノハブディティス・エレガンスにおける細胞構造およびオルガネラ形態学を研究するための定量的アプローチ、J.Vis. Exp. (2019)
イメージング用スライドの準備
- マイクロ波安全ボトル(超純水100mLで3〜4g)に3〜4%のアガロースストックを用意します。
注: 寒天は同じ濃度でアガロースの代わりに使用することができます。 - すべてのアガロースが溶解するまで、沸騰しないように注意して、電子レンジで慎重にアガロースを溶かします(透明な溶液)。固化を防ぐために、溶液を70°Cに保ちます。
注: アガロース在庫は、数回使用することができます。アガロースが固まった場合は、使用前に再加熱します。 - パスツールピペットを使用して、溶かしたアガロースを顕微鏡スライドに置きます。
注: これらはパッドの完全性を乱すので寒天の滴に気泡を持つことを避けてください。 - すぐに別の顕微鏡スライドでアガロース液滴を押し下げ、アガロースを2つのスライド間のパッドに静かに平らにします。
注: 残った気泡は、この段階で除去する必要があります。そうでなければ、動物が泡の中で簡単に立ち往生する可能性がありますので、新しいスライドを作る必要があります。スライドを押すときは寒天が横にあふれないようにします。 - アガロースを1分間乾燥させます。
- 2つのスライドを慎重に分離してアガロースの損傷を避け、いずれかのスライドに固めたパッドを残します。
注: アガロースパッド付きのスライドは、乾燥させることができるので、実験の直前に常に新鮮に準備する必要があります。アガロースパッドの厚さが一貫していることを確認してください。これは、画像処理を妨げる可能性があるため、パッドに気泡や亀裂が存在する必要はありません。 - アガロースパッドの中央に0.05%のテトラミソール塩酸塩(麻酔薬)の小さな滴(5-10 μL)を加えます。
- 熱殺菌されたピックを使用して、溶液が乾燥する前に、ストックプレートから麻酔液滴に約10〜15匹の動物を素早く移します。これは、イメージングを妨げる可能性があり、溶液を曇らせるので、あまりにも多くのOP50細菌を転送しないようにしてください。
注: 麻酔液が摘み取り中に乾燥した場合、動物に0.05%の四状子塩酸塩の2番目の滴をピペットするだけです。動物は麻酔液の側側に横たわる傾向がある。 - アガロースパッドのすぐ上に置き、そっと落とすことでカバースリップを適用します。これは、気泡の形成を防ぐことができます。これは動物をつぶす可能性があるため、カバースリップに圧力をかけないでください。
- 歪みの名前をスライドにラベル付けします。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |