Nematode Slide Preparation: En metode for å montere dyr på en Agar Pad

Overview

Under levende avbildning av C. eleganskan en agarosepute brukes til å holde nematoden stille uten å skade eller tørke den.  Denne videoen beskriver hvordan du klargjør en enkel monteringspute for mikroskopi.

Protocol

Denne protokollen er hentet fra Teoh et al, Kvantitative tilnærminger for å studere cellulære strukturer og organellemorfologi i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

Forberedelse av lysbilder for avbildning

1. Forbered 3-4% m / v agarose lager i en mikrobølgesikker flaske (3-4 g i 100 ml ultrarent vann).
   MERK: Agar kan brukes i stedet for agarose i samme konsentrasjon.
2. Smelt agarose forsiktig i en mikrobølgeovn, pass på at du ikke overkoker, til alle agarose oppløses (klar løsning). Hold oppløsningen ved 70 °C for å forhindre størkning.
   MERK: Agarose lager kan brukes flere ganger. Varmes opp igjen før bruk hvis agarose har størknet.
3. Bruk en Pasteur pipette, plasser en dråpe smeltet agarose på et mikroskop lysbilde.
   MERK: Unngå å ha luftbobler i dråpen av agar, da disse forstyrrer integriteten til puten.
4. Trykk straks ned agarosedråpen med et annet mikroskopsklie, og flat forsiktig sammen agaroseen til en pute mellom de to lysbildene.
   MERK: Eventuelle rester av bobler bør fjernes på dette stadiet. Hvis ikke, bør nye lysbilder gjøres da dyr lett kan sitte fast i boblene. Unngå overløp av agar til siden når du trykker på lysbildet.
5. La agarose tørke i 1 min.
6. Separer forsiktig de to lysbildene for å unngå skade på agarose, mens du lar den størkne puten stå på en av lysbildene.
   MERK: Lysbilder med agarose pads bør alltid tilberedes friskt like før eksperimentet, da de kan tørke ut. Kontroller at agaroseputen har en jevn tykkelse. Det bør ikke være luftbobler eller sprekker i puten, da dette kan forstyrre avbildningen.
7. Tilsett en liten dråpe (5-10 μL) på 0,05% tetramisolhydroklorid (bedøvelse) i midten av agaroseputen.
8. Ved hjelp av varmesterilisert plukk, overfør raskt ca 10 - 15 dyr fra lagerplaten til bedøvelsesdråpen før løsningen tørker ut. Unngå å overføre for mye OP50-bakterier, da dette gjør løsningen overskyet, noe som kan forstyrre avbildningen.
   MERK: Hvis bedøvelsesløsningen tørker ut mens du plukker, bare pipette en andre dråpe på 0,05% tetramisolhydroklorid på dyrene. Dyrene har en tendens til å ligge på sidesiden i bedøvelsesløsningen.
9. Påfør en deksleslip ved å plassere den like over agaroseputen og forsiktig slippe den ned. Dette vil forhindre dannelse av bobler. Ikke legg press på dekslene, da dette kan knuse dyrene.
10. Merk lysbildene med strekknavnet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G